水稻ospt4转基因材料的构建与鉴定
摘要：磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，也是植物生长发育限制因子之一。研究表明，植物磷酸盐转运蛋白介导了植物磷的吸收及转运。水稻是重要的粮食作物与模式植物,因此研究水稻对磷的吸收利用和转运机理以便更好的利用有限的磷资源,具有重要的理论和现实意义。本研究在获得水稻磷酸盐转运蛋白基因OsPT4序列的基础上，利用分子生物学手段对OsPT4进行沉默和超表达，从而获得相应的研究材料。研究的主要结果是：完成了对OsPT4的超表达载体及沉默表达载体的构建；在水稻测序品种日本晴中进行了遗传转化，获得转化苗，并对阳性株系进行了表达检测分析及拷贝数的鉴定，为后续深入研究该基因的功能、筛选磷养分高效水稻品种创制材料。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料 2
1．2 OsPT4转基因材料的构建 3
1．2．1 OsPT4基因超表达载体的构建 3
1．2．2 OsPT4基因RNAi干涉载体的构建 3
1．2．3 农杆菌介导的水稻转化 5
1．3 OsPT4转基因材料的分析鉴定 7
1．3．1 转基因水稻材料阳性苗的检测 7
1．3．2 转基因材料中OsPT4的表达检测 7
1．3．3 OsPT4Ox/ Ri转基因株系拷贝数的鉴定 8
2 结果与分析 8
2．1 OsPT4转基因材料阳性苗的统计 8
2．2 OsPT4超表达和RNAi材料的超表达与沉默效果的鉴定 8
2．3 OsPT4超表达和RNAi株系的拷贝数分析 9
2．4 OsPT4转基因水稻的表型分析 10
3 讨论 11
致谢 11
参考文献 12
附录一 14
附录二 17
附录三 18
水稻OsPT4转基因材料的构建与鉴定
引言
引言
磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
广泛参与植物体内的生物合成、能量转移、信号转导等代谢过程。同时，在种子萌发，花粉发育，种子与果实的形成等植物生命延续过程中也起着关键作用[1,2]。虽然土壤中磷元素含量很高，然而大约80%的磷是以有机态的形式存在[3]，而且可溶的磷酸根离子在酸性和碱性土壤中易被钙、镁、铝、铁等离子及其他化合物固定形成难溶态的磷，难以被植物吸收利用，因而土壤中实际有效磷的含量平均只有1～2 μM[1,4]，即使在肥沃的土壤中，可利用磷的浓度也很少超过10 μM[5]，远远低于植物组织中的磷浓度(5～20 mM)[1]。植物体内缺磷，通常会阻碍蛋白质的合成，减少细胞质和细胞核的形成，影响细胞正常分裂，导致植株生长缓慢，最终在形态结构上表现出植株矮小、苍老，茎细直立，叶片变小，叶色暗绿或灰绿色，缺少光泽，分枝减少[6]。植物为了适应土壤中的缺磷环境，经过长期进化形成了一系列的适应性反应，包括改变根系形态结构、增加有机酸的分泌、与菌根真菌形成菌根共生体以及增强或诱导高亲和磷转运蛋白基因的表达等途径来活化和提高土壤中磷的生物有效性。
植物根系对磷素营养的吸收主要是通过定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白（Phosphate Transporter,PT）将根系截获的正磷酸盐（H2PO4，Pi）通过质子共转运的方式运输到植物体内[7,8]。因此，植物对磷的吸收效率取决于细胞质膜上磷转运蛋白的数量及其对磷酸根离子的亲和性[9,10]。依据可转运介质中有效磷浓度的高低, 植物磷酸盐转运蛋白粗分为低亲和力和高亲和力两大类[1113]。按序列和功能相似性将目前已知的磷转运蛋白分Pht1、Pht2、Pht3和Pht4四大家族[1416]。目前所克隆到的磷转运蛋白基因极大部分属于H2PO4/nH+共运体的Pht1小家族，后者又归属于一个更大的溶质转运子家族MFS。
自从Muchhal等[17]首先在拟南芥中克隆两个磷转运蛋白基因以来, 近年来磷转运蛋白基因被克隆的高等植物包括: 苜蓿、水稻、小麦、大麦、玉米、番茄、土豆、烟草、辣椒、茄子等[1825]。研究表明大多数Pht1基因在根部表达，并且受低磷增强或诱导表达[2,21,22,27,28]，研究还发现，拟南芥Pht1家族成员除了在根部表达，一部分Pht1基因在茎、叶片、子叶、花器官表达[2830]。Ai等[31]和Liu等[32]利用基因沉默的OsPT2和OsPT6突变水稻材料和OsPT2超表达材料研究表明，OsPT2主要负责磷酸盐的运输，是低亲和转运蛋白；而OsPT6负责磷酸盐的吸收和转运，为高亲和磷转运蛋白。
本文以水稻磷转运蛋白基因OsPT4为研究对象，以水稻测序品种日本晴（Nipponbare）为试验材料，通过创建OsPT4转基因材料并对其进行鉴定，获得OsPT4敲除/沉默材料及超表达，为研究OsPT4在籽粒形成过程中的生理功能，进而培育磷高效利用水稻新品种打下基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
供试植物：水稻（日本晴Nipponbare）
供试载体：pMD19T（购自TaKaRa公司）；pNW55、pTCK303由本实验室保存。
供试菌株：大肠杆菌：Escherichia coli，DH5α，用作质粒的转化宿主；
根癌农杆菌: Agrobacterium tumefaciens，EHA105，用作水稻转基因。
以上均由本实验室保存。
主要试剂：Taq DNA polymerase，dNTP，T4 DNA连接酶，加polyA反应液，以及限 制性内切酶EcoRI和BamHI均购自TaKaRa公司；PIPsp1购自NEB公司；MS培养基购自上海鼎国公司；Agarose、GUS染液均购自Sigma公司；凝胶回收试剂盒购于AXYGEN公司；抗生素均购自南京基天生物技术有限公司；PCR Mix和SYBR PremixExTaq Kit分别购自东盛和TaKaRa生物试剂公司。LA Taq DNA polymerase，dNTP，；Ascl，Pacl，购于Biolabs公司。质粒提取纯化试剂盒（QIAGEN, UK）；cRNA合成试剂盒（MEGAscriPTT7kit, Ambion）。KH2PO4等常用化学药品均购自鼎国公司。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 试验材料 2
1．2 OsPT4转基因材料的构建 3
1．2．1 OsPT4基因超表达载体的构建 3
1．2．2 OsPT4基因RNAi干涉载体的构建 3
1．2．3 农杆菌介导的水稻转化 5
1．3 OsPT4转基因材料的分析鉴定 7
1．3．1 转基因水稻材料阳性苗的检测 7
1．3．2 转基因材料中OsPT4的表达检测 7
1．3．3 OsPT4Ox/ Ri转基因株系拷贝数的鉴定 8
2 结果与分析 8
2．1 OsPT4转基因材料阳性苗的统计 8
2．2 OsPT4超表达和RNAi材料的超表达与沉默效果的鉴定 8
2．3 OsPT4超表达和RNAi株系的拷贝数分析 9
2．4 OsPT4转基因水稻的表型分析 10
3 讨论 11
致谢 11
参考文献 12
附录一 14
附录二 17
附录三 18
水稻OsPT4转基因材料的构建与鉴定
引言
引言
磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
广泛参与植物体内的生物合成、能量转移、信号转导等代谢过程。同时，在种子萌发，花粉发育，种子与果实的形成等植物生命延续过程中也起着关键作用[1,2]。虽然土壤中磷元素含量很高，然而大约80%的磷是以有机态的形式存在[3]，而且可溶的磷酸根离子在酸性和碱性土壤中易被钙、镁、铝、铁等离子及其他化合物固定形成难溶态的磷，难以被植物吸收利用，因而土壤中实际有效磷的含量平均只有1～2 μM[1,4]，即使在肥沃的土壤中，可利用磷的浓度也很少超过10 μM[5]，远远低于植物组织中的磷浓度(5～20 mM)[1]。植物体内缺磷，通常会阻碍蛋白质的合成，减少细胞质和细胞核的形成，影响细胞正常分裂，导致植株生长缓慢，最终在形态结构上表现出植株矮小、苍老，茎细直立，叶片变小，叶色暗绿或灰绿色，缺少光泽，分枝减少[6]。植物为了适应土壤中的缺磷环境，经过长期进化形成了一系列的适应性反应，包括改变根系形态结构、增加有机酸的分泌、与菌根真菌形成菌根共生体以及增强或诱导高亲和磷转运蛋白基因的表达等途径来活化和提高土壤中磷的生物有效性。
植物根系对磷素营养的吸收主要是通过定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白（Phosphate Transporter,PT）将根系截获的正磷酸盐（H2PO4，Pi）通过质子共转运的方式运输到植物体内[7,8]。因此，植物对磷的吸收效率取决于细胞质膜上磷转运蛋白的数量及其对磷酸根离子的亲和性[9,10]。依据可转运介质中有效磷浓度的高低, 植物磷酸盐转运蛋白粗分为低亲和力和高亲和力两大类[1113]。按序列和功能相似性将目前已知的磷转运蛋白分Pht1、Pht2、Pht3和Pht4四大家族[1416]。目前所克隆到的磷转运蛋白基因极大部分属于H2PO4/nH+共运体的Pht1小家族，后者又归属于一个更大的溶质转运子家族MFS。
自从Muchhal等[17]首先在拟南芥中克隆两个磷转运蛋白基因以来, 近年来磷转运蛋白基因被克隆的高等植物包括: 苜蓿、水稻、小麦、大麦、玉米、番茄、土豆、烟草、辣椒、茄子等[1825]。研究表明大多数Pht1基因在根部表达，并且受低磷增强或诱导表达[2,21,22,27,28]，研究还发现，拟南芥Pht1家族成员除了在根部表达，一部分Pht1基因在茎、叶片、子叶、花器官表达[2830]。Ai等[31]和Liu等[32]利用基因沉默的OsPT2和OsPT6突变水稻材料和OsPT2超表达材料研究表明，OsPT2主要负责磷酸盐的运输，是低亲和转运蛋白；而OsPT6负责磷酸盐的吸收和转运，为高亲和磷转运蛋白。
本文以水稻磷转运蛋白基因OsPT4为研究对象，以水稻测序品种日本晴（Nipponbare）为试验材料，通过创建OsPT4转基因材料并对其进行鉴定，获得OsPT4敲除/沉默材料及超表达，为研究OsPT4在籽粒形成过程中的生理功能，进而培育磷高效利用水稻新品种打下基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
供试植物：水稻（日本晴Nipponbare）
供试载体：pMD19T（购自TaKaRa公司）；pNW55、pTCK303由本实验室保存。
供试菌株：大肠杆菌：Escherichia coli，DH5α，用作质粒的转化宿主；
根癌农杆菌: Agrobacterium tumefaciens，EHA105，用作水稻转基因。
以上均由本实验室保存。
主要试剂：Taq DNA polymerase，dNTP，T4 DNA连接酶，加polyA反应液，以及限 制性内切酶EcoRI和BamHI均购自TaKaRa公司；PIPsp1购自NEB公司；MS培养基购自上海鼎国公司；Agarose、GUS染液均购自Sigma公司；凝胶回收试剂盒购于AXYGEN公司；抗生素均购自南京基天生物技术有限公司；PCR Mix和SYBR PremixExTaq Kit分别购自东盛和TaKaRa生物试剂公司。LA Taq DNA polymerase，dNTP，；Ascl，Pacl，购于Biolabs公司。质粒提取纯化试剂盒（QIAGEN, UK）；cRNA合成试剂盒（MEGAscriPTT7kit, Ambion）。KH2PO4等常用化学药品均购自鼎国公司。
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