三株真菌的鉴定及其拮抗尖孢镰刀菌的特性研究
番茄枯萎病是全球性的真菌土传病害，严重制约着番茄的生产。已有研究证明利用拮抗菌能有效防控番茄枯萎病的发生，本研究重点研究不同种微生物及其协作对尖孢镰刀菌的拮抗能力。本实验从番茄根际分离纯化出三种不同种属的具有拮抗功能的真菌，通过形态鉴定结合分子鉴定，分别被鉴定为梭孢壳属真菌(B20)，黑曲霉(C2)和淡紫紫孢菌(C18)；通过平板对峙，测量接入不同种属拮抗菌及其组合菌前后和番茄苗生物量变化，评估了菌株的功效，平板对峙实验结果显示，三株真菌对尖孢镰刀菌都能产生抑制作用，抑菌效果C2>C18>B20；通过分析处理组与空白对照组生物量的显著性差异，三株单菌的四组组合菌都能促进番茄生长，其中单菌C2，组合菌C18C2和C18B20能显著促进番茄生长。通过平板涂布计数，发现三株菌组合平板的病原菌菌落数最少，抗菌效果最好。本实验为番茄枯萎病拮抗菌的筛选鉴定以及特性研究提供了较好的思路，对于枯萎病的生物防治具有重要意义。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言(或绪论)3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2实验方法 4
1.2.1真菌的筛选和纯化5
1.2.2真菌的形态和分子鉴定5
1.2.3对峙实验5
1.2.4真菌孢子悬液的制备5
1.2.5盆栽试验设计 6
1.2.6 数据处理与分析6
2结果与分析6
2.1形态鉴定6
2.2不同真菌的分子鉴定7
2.3拮抗菌的抑菌率与拮抗效果10
2.4盆栽实验结果10
3讨论 18
致谢19
参考文献19
三株真菌的鉴定及其拮抗尖孢镰刀菌的特性研究
引言
引言
自上世纪番茄枯萎病出现以来，世界各地的番茄种植区随处可见枯萎病。番茄枯萎病的致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，会引起植物根部腐烂、维管束变成褐色及植株萎蔫，导致茄科、芭蕉科与葫芦科等许多重要农作物严重减产，一般造成 10% ～30%产量损失，甚至绝收 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
[1]。农业部调查显示，中国番茄种植面积于2001年达到了100 万 hm2 ，高居亚洲第一，世界第二。据数据统计，中国每年的番茄种植面积都达到了 110 万 hm2 左右。由于番茄种植面积的不断扩张，番茄的各种病虫害逐渐显露危机，尤其是在保护地种植的的番茄病虫害更为严重。在一系列病虫害中，番茄枯萎病最为严重，枯萎病的产生大大降低了番茄的产量和品质。目前防治番茄枯萎病的方法主要分为两类:一是改良土壤品质，施加腐熟优质有机肥，根据气候环境不断调节土壤酸碱度，同时合理调节N、P和K肥的比例。番茄苗在移栽前10天，每公顷地施加生石灰3000~4500 kg，或者每公顷施加壳灰粉草木灰4500 kg，目的是为了降低土壤酸度。通过改进土壤品质，一方面可以改变土壤的理化性状，另一方面还可抑制土壤中多种病原菌的生长，这一举措对控制番茄枯萎病的爆发有非常明显的作用。番茄幼苗期的重点是预防枯萎病，提倡直接播种，可以适当迟后苗的播种日期。二是采用生物防治：从番茄根际分离出具有拮抗功能的真菌，不同种属的拮抗菌有不同的生态位，可以在同一微生物环境协作抵御病原菌。
其中具有典型代表性质的生防真菌主要有黑曲霉菌，淡紫紫孢霉，梭孢壳菌等。黑曲霉菌，该菌株可以有效降解土壤溶液中的肉桂酸,从而缓解肉桂酸对黄瓜发芽的抑制作用，促进作物的生长发芽。在杀线虫生防真菌中，黑曲霉是分布最广的一种。有研究表明，黑曲霉对植物寄生线虫的卵、幼虫、成虫均有较好的毒杀作用，这归咎于它可以产生毒素，田间试验处理番茄和辣椒根际南方根结线虫和肾形线虫，线虫数量显著减少。淡紫紫孢菌，原名为淡紫拟青霉[2]，最初由 Jatala 于 1979 年在南方根结线虫卵中分离获得[3]，大量研究表明该菌对多种植物线虫都有较强的寄生性和致病性[46]。菲律宾亚洲技术中心研制的淡紫紫孢菌制剂“BIOCON”，已被美国、秘鲁等国家用于防治马铃薯线虫[7]。我国也有多个淡紫紫孢菌制剂被商品化生产，主要用于防治大豆、番茄等作物的根结线虫和胞囊线虫。除线虫外，淡紫紫孢菌还可在荔枝蝽象、叶蝉、褐飞虱等多种昆虫体表寄生[812]，对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌和柑橘绿霉病菌等多种植物病原菌有一定的拮抗作用[13]，其代谢产物还可促进种子萌发、促进植物根系和植株生长[1415]等。梭孢壳真菌：属于毛壳菌，毛壳菌抗植物病原菌的机制可能有5种：产生具有抗菌性能的代谢产物、产生细胞壁降解酶、菌寄生、竞争和诱发植物产生防卫反应。
本论文选择实验室保存的三株真菌，评估了不同真菌对病原菌的抑制能力，进行了三株菌及其组合对番茄植株的促生作用及对尖孢镰刀菌的防控效果，并最终对三株真菌进行了鉴定。研究结果预计能够对番茄枯萎病的防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从番茄根际筛选出的三株真菌（大学资源环境学院植物营养系实验室保存的三株真菌）
番茄种子：上海合作903
育苗基质：珍珠岩和蛭石1: 1混合
霍格兰营养液：硝酸钾 607 mg/L，磷酸铵 115 mg/L，硫酸镁 493 mg/L，铁盐溶液 2.5 ml/L。
尖孢镰刀菌(K2)选择性培养基(1L)：磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g。氯化钾0.5g，FeEDTA0.01g，L天门冬酰胺0.01g，D半乳糖20g，灭菌后，再加入五氯硝基苯(可融于丙酮溶液)1g，牛胆汁1g，十水硼酸钠1g，0.3g硫酸链霉素
微量元素 5ml/L，pH=6.0
育苗盘，LB培养基，PDA培养基，培养皿，封口膜，自封袋。
1.2实验方法
1.2.1真菌的筛选和纯化
采集横溪蔬菜所土样共 60 份。采用梯度稀释涂板法分离拮抗细菌。将 10－3 、10 －4 、10－5土壤稀释液，各吸取 100μl，均匀涂布于 LB 和 PDA 固体平板上，置于 28 ℃
培养箱中培养3 ～4 d。病原细菌和病原真菌拮抗细菌的分离、纯化和培养分别在 LB 培养基和 PDA 培养基中进行。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言(或绪论)3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2实验方法 4
1.2.1真菌的筛选和纯化5
1.2.2真菌的形态和分子鉴定5
1.2.3对峙实验5
1.2.4真菌孢子悬液的制备5
1.2.5盆栽试验设计 6
1.2.6 数据处理与分析6
2结果与分析6
2.1形态鉴定6
2.2不同真菌的分子鉴定7
2.3拮抗菌的抑菌率与拮抗效果10
2.4盆栽实验结果10
3讨论 18
致谢19
参考文献19
三株真菌的鉴定及其拮抗尖孢镰刀菌的特性研究
引言
引言
自上世纪番茄枯萎病出现以来，世界各地的番茄种植区随处可见枯萎病。番茄枯萎病的致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，会引起植物根部腐烂、维管束变成褐色及植株萎蔫，导致茄科、芭蕉科与葫芦科等许多重要农作物严重减产，一般造成 10% ～30%产量损失，甚至绝收 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
[1]。农业部调查显示，中国番茄种植面积于2001年达到了100 万 hm2 ，高居亚洲第一，世界第二。据数据统计，中国每年的番茄种植面积都达到了 110 万 hm2 左右。由于番茄种植面积的不断扩张，番茄的各种病虫害逐渐显露危机，尤其是在保护地种植的的番茄病虫害更为严重。在一系列病虫害中，番茄枯萎病最为严重，枯萎病的产生大大降低了番茄的产量和品质。目前防治番茄枯萎病的方法主要分为两类:一是改良土壤品质，施加腐熟优质有机肥，根据气候环境不断调节土壤酸碱度，同时合理调节N、P和K肥的比例。番茄苗在移栽前10天，每公顷地施加生石灰3000~4500 kg，或者每公顷施加壳灰粉草木灰4500 kg，目的是为了降低土壤酸度。通过改进土壤品质，一方面可以改变土壤的理化性状，另一方面还可抑制土壤中多种病原菌的生长，这一举措对控制番茄枯萎病的爆发有非常明显的作用。番茄幼苗期的重点是预防枯萎病，提倡直接播种，可以适当迟后苗的播种日期。二是采用生物防治：从番茄根际分离出具有拮抗功能的真菌，不同种属的拮抗菌有不同的生态位，可以在同一微生物环境协作抵御病原菌。
其中具有典型代表性质的生防真菌主要有黑曲霉菌，淡紫紫孢霉，梭孢壳菌等。黑曲霉菌，该菌株可以有效降解土壤溶液中的肉桂酸,从而缓解肉桂酸对黄瓜发芽的抑制作用，促进作物的生长发芽。在杀线虫生防真菌中，黑曲霉是分布最广的一种。有研究表明，黑曲霉对植物寄生线虫的卵、幼虫、成虫均有较好的毒杀作用，这归咎于它可以产生毒素，田间试验处理番茄和辣椒根际南方根结线虫和肾形线虫，线虫数量显著减少。淡紫紫孢菌，原名为淡紫拟青霉[2]，最初由 Jatala 于 1979 年在南方根结线虫卵中分离获得[3]，大量研究表明该菌对多种植物线虫都有较强的寄生性和致病性[46]。菲律宾亚洲技术中心研制的淡紫紫孢菌制剂“BIOCON”，已被美国、秘鲁等国家用于防治马铃薯线虫[7]。我国也有多个淡紫紫孢菌制剂被商品化生产，主要用于防治大豆、番茄等作物的根结线虫和胞囊线虫。除线虫外，淡紫紫孢菌还可在荔枝蝽象、叶蝉、褐飞虱等多种昆虫体表寄生[812]，对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌和柑橘绿霉病菌等多种植物病原菌有一定的拮抗作用[13]，其代谢产物还可促进种子萌发、促进植物根系和植株生长[1415]等。梭孢壳真菌：属于毛壳菌，毛壳菌抗植物病原菌的机制可能有5种：产生具有抗菌性能的代谢产物、产生细胞壁降解酶、菌寄生、竞争和诱发植物产生防卫反应。
本论文选择实验室保存的三株真菌，评估了不同真菌对病原菌的抑制能力，进行了三株菌及其组合对番茄植株的促生作用及对尖孢镰刀菌的防控效果，并最终对三株真菌进行了鉴定。研究结果预计能够对番茄枯萎病的防控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从番茄根际筛选出的三株真菌（大学资源环境学院植物营养系实验室保存的三株真菌）
番茄种子：上海合作903
育苗基质：珍珠岩和蛭石1: 1混合
霍格兰营养液：硝酸钾 607 mg/L，磷酸铵 115 mg/L，硫酸镁 493 mg/L，铁盐溶液 2.5 ml/L。
尖孢镰刀菌(K2)选择性培养基(1L)：磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g。氯化钾0.5g，FeEDTA0.01g，L天门冬酰胺0.01g，D半乳糖20g，灭菌后，再加入五氯硝基苯(可融于丙酮溶液)1g，牛胆汁1g，十水硼酸钠1g，0.3g硫酸链霉素
微量元素 5ml/L，pH=6.0
育苗盘，LB培养基，PDA培养基，培养皿，封口膜，自封袋。
1.2实验方法
1.2.1真菌的筛选和纯化
采集横溪蔬菜所土样共 60 份。采用梯度稀释涂板法分离拮抗细菌。将 10－3 、10 －4 、10－5土壤稀释液，各吸取 100μl，均匀涂布于 LB 和 PDA 固体平板上，置于 28 ℃
培养箱中培养3 ～4 d。病原细菌和病原真菌拮抗细菌的分离、纯化和培养分别在 LB 培养基和 PDA 培养基中进行。
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