氨氧化微生物对土壤氮含量变化的响应研究(附件)
摘要：土壤微生物在调控土壤生态平衡的过程中具有重要作用，其丰度和群落结构能够调节土壤物质流通和能量循环。硝化作用将土壤铵态氮转化为硝态氮并调控土壤氮的动态变化。包括氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）在内的氨氧化微生物参与硝化作用并响应土壤氮含量的变化。本研究依托于兰州大学高寒草甸生态系统玛曲野外定位研究站，以高寒草甸土为对象，研究氨氧化微生物在不同氮肥（(NH4)2HPO4）添加处理下土壤中氨氧化微生物amoA基因拷贝数的变化。研究发现施氮量增加可以改变氨氧化微生物的丰度，从而影响硝化反应速率。该研究发现对于如何通过调控土壤中氨氧化微生物种群数量来提高氮肥利用率等方面具有潜在意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 绪论 2
1.1 研究意义 2
1.2 国内外研究概况 2
1.3 研究地概况 3
1.4 实验设计与处理 3
1.5 研究问题 3
2 材料与方法 4
2.1 土壤样品的采集 4
2.2 样品分析 4
2.2.1 土壤基本理化性质的测定 4
2.2.2 土壤DNA的提取 4
2.2.3 氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因的荧光定量PCR 4
2.3 统计分析 5
3 结果与分析 5
3.1 氮肥用量对土壤养分含量的影响 5
3.1.1 氮肥用量对土壤有机碳的影响 5
3.1.2 pH和氮素养分（全氮，NH4+，NO3）的随氮肥添加的变化趋势 6
3.2 氨氧化微生物对氮梯度的响应 7
3.2.1 氮肥用量对氨氧化细菌（AOB）的影响 7
3.2.2 氮肥用量对氨氧化古菌（AOA）的影响 8
3.2.3 氮肥用量对月均氨氧化微生物丰度的影响 8
3.2.4 氮肥用量对AOA/AOB的影响 9
3.2.5 氨氧化微生物丰度在pH变化下的变化趋势 10
4 结论与讨论 11
4.1 结论 11
/> 4.2 讨论 12
4.2.1 在时间尺度上土壤养分含量的变化 12
4.2.2 选择合适氮肥的施用量调控硝化反应以指导农业施肥 12
4.2.3 氨氧化细菌和氨氧化古菌硝化反应的相对贡献 12
5 研究展望 13
5.1 创新与特色 13
5.2 研究展望 13
5.2.1 扩大研究范围 13
5.2.2 从多个角度抑制硝化反应 13
致谢 14
参考文献 15
氨氧化微生物对土壤氮含量变化的响应研究
引言
研究意义
氮是植物必需的营养元素之一，也是评价土壤质量和地力的重要指标。据统计，农田中每年约投入100 Tg氮肥，投入量占全球氮平衡的25%[1]，并且主要以铵态氮肥（NH4+N）的形式投入。虽然氮的投入量大但施入土壤中的氮约有35%会通过各种途径损失掉[23]。这部分损失的氮肥会造成诸如地下水硝酸盐超标、水体富营养化、温室气体和致酸雨气体的排放等环境污染[4]。例如2 000年，比利时80%的饮用水中硝酸盐含量超标[5]。
大量氮肥施入土壤之后，在一系列微生物的作用下发生硝化反应。铵态氮在氨氧化微生物的作用下被氧化成亚硝态氮；然后转化为硝态氮。硝化作用（包括氨氧化亚硝酸和亚硝酸氧化为硝酸）在土壤中普遍存在，在土壤氮循环中发挥积极作用。氨氧化作用作为硝化反应的第一步，也是整个过程的限速步骤[67]，氨氧化微生物（包括氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA））是氨氧化作用的重要参与者，故对硝化作用起到了决定性的作用。因此，研究土壤中不同氮含量对氨氧化菌丰度的影响对于调控硝化反应，提高氮肥利用率，减少因施肥造成的环境污染具有重要意义。同时也可以作为调控农田生态系统氮循环的重要依据。
国内外研究概况
1888年科学家第一次分离出氨氧化细菌时，它被普遍认为是唯一的氨氧化微生物[8]。测序技术和分子生态学研究手段的引进之后，Venter等人[9]于2004年发现了氨氧化功能基因amoA，同时验证了氨氧化古菌的存在。2005年，非极端环境海洋“古菌”纯菌株被首次分离培养出来，研究者发现其在氧化氨态氮获得氮源的同时同化CO2获得碳源[10]。自此，氨氧化古菌可以将NH3氧化成NO2的性质被发现，人们也逐渐认可了其与氨氧化细菌相同的功能。
贺纪正等近来对农田土壤生态系统中氨氧化细菌和氨氧化古菌的丰度、组成及对环境的响应进行了一系列研究，取得重要进展 [1113]。由于环境中绝大多数氨氧化微生物都是难培养的，所以传统的可培养方法已经满足不了氨氧化物定量分析的要求。在分子生物技术发展的大背景下，分子生物技术的发展极大地扩展了氨氧化微生物的研究领域。在定量方法方面出现了实时荧光定量PCR、荧光原位杂交FISH等手段。而在定性方法方面，有如扩增rDNA 限制性酶切ARDRA、变性梯度凝胶电泳DGGE、和构建环境 16SrRNA基因克隆文库等方法。此外，焦磷酸测序、稳定性同位素核酸探针技术也是目前较前沿的新兴技术。
本试验所用到的定量PCR技术作为氨氧化物定量分析的方法的一种，通常用来研究土壤微生物特定种群的丰度，定量分析土壤总DNA和RNA的提取效率等[1415]。
研究地概况
试验地所在的兰州大学高寒草甸与湿地生态系统定位研究站位于地处黄河第一湾的甘肃省甘南藏族自治州玛曲县境内。该区习惯上被人们称为若尔盖湿地。它不仅是我国最大的高寒沼泽湿地区域，也是黄河最重要的水源补给区，整个源区58%的水量依赖于补给。该区域有“四最”：“一最”为整个青藏高原高寒草地地上部分生物量最高（平均鲜草产量为3 400 kghm2）；“二最”为植物群落物种最为丰富（每平方米60余种）；“三最”为人口最为密集；“四最”为载畜量最高。生态系统研究站建立于此也弥补了青藏高原上现有台站的不足之处。
采样地点为甘肃省玛曲县境内的兰州大学高寒草甸生态系统玛曲野外定位研究站哇乐卡试验点，土壤的主要类型为亚高山草甸土。样地的地理坐标为35°58′ N，101°53′ E，海拔高约3.5 km；年均气温为1.2 ℃，月平均气温最冷月（1月）为10 ℃，最热月（7 月）可达11.7 ℃，年降水量约为620 mm，属高寒湿润气候；年日照时数约2 580 h，霜期大于270天。
实验样地物种丰富，平均每0.25平方米就有2035个物种，地上干生物量达280400 gm2。较典型的优势物种是禾叶嵩草（Kobresia graminifolia Clarke.）、垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）、波伐早熟禾（Poa botryoides Ttin.）和草玉梅（Anemone rivularis BuchHam. ex DC）等。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 绪论 2
1.1 研究意义 2
1.2 国内外研究概况 2
1.3 研究地概况 3
1.4 实验设计与处理 3
1.5 研究问题 3
2 材料与方法 4
2.1 土壤样品的采集 4
2.2 样品分析 4
2.2.1 土壤基本理化性质的测定 4
2.2.2 土壤DNA的提取 4
2.2.3 氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA基因的荧光定量PCR 4
2.3 统计分析 5
3 结果与分析 5
3.1 氮肥用量对土壤养分含量的影响 5
3.1.1 氮肥用量对土壤有机碳的影响 5
3.1.2 pH和氮素养分（全氮，NH4+，NO3）的随氮肥添加的变化趋势 6
3.2 氨氧化微生物对氮梯度的响应 7
3.2.1 氮肥用量对氨氧化细菌（AOB）的影响 7
3.2.2 氮肥用量对氨氧化古菌（AOA）的影响 8
3.2.3 氮肥用量对月均氨氧化微生物丰度的影响 8
3.2.4 氮肥用量对AOA/AOB的影响 9
3.2.5 氨氧化微生物丰度在pH变化下的变化趋势 10
4 结论与讨论 11
4.1 结论 11
/> 4.2 讨论 12
4.2.1 在时间尺度上土壤养分含量的变化 12
4.2.2 选择合适氮肥的施用量调控硝化反应以指导农业施肥 12
4.2.3 氨氧化细菌和氨氧化古菌硝化反应的相对贡献 12
5 研究展望 13
5.1 创新与特色 13
5.2 研究展望 13
5.2.1 扩大研究范围 13
5.2.2 从多个角度抑制硝化反应 13
致谢 14
参考文献 15
氨氧化微生物对土壤氮含量变化的响应研究
引言
研究意义
氮是植物必需的营养元素之一，也是评价土壤质量和地力的重要指标。据统计，农田中每年约投入100 Tg氮肥，投入量占全球氮平衡的25%[1]，并且主要以铵态氮肥（NH4+N）的形式投入。虽然氮的投入量大但施入土壤中的氮约有35%会通过各种途径损失掉[23]。这部分损失的氮肥会造成诸如地下水硝酸盐超标、水体富营养化、温室气体和致酸雨气体的排放等环境污染[4]。例如2 000年，比利时80%的饮用水中硝酸盐含量超标[5]。
大量氮肥施入土壤之后，在一系列微生物的作用下发生硝化反应。铵态氮在氨氧化微生物的作用下被氧化成亚硝态氮；然后转化为硝态氮。硝化作用（包括氨氧化亚硝酸和亚硝酸氧化为硝酸）在土壤中普遍存在，在土壤氮循环中发挥积极作用。氨氧化作用作为硝化反应的第一步，也是整个过程的限速步骤[67]，氨氧化微生物（包括氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA））是氨氧化作用的重要参与者，故对硝化作用起到了决定性的作用。因此，研究土壤中不同氮含量对氨氧化菌丰度的影响对于调控硝化反应，提高氮肥利用率，减少因施肥造成的环境污染具有重要意义。同时也可以作为调控农田生态系统氮循环的重要依据。
国内外研究概况
1888年科学家第一次分离出氨氧化细菌时，它被普遍认为是唯一的氨氧化微生物[8]。测序技术和分子生态学研究手段的引进之后，Venter等人[9]于2004年发现了氨氧化功能基因amoA，同时验证了氨氧化古菌的存在。2005年，非极端环境海洋“古菌”纯菌株被首次分离培养出来，研究者发现其在氧化氨态氮获得氮源的同时同化CO2获得碳源[10]。自此，氨氧化古菌可以将NH3氧化成NO2的性质被发现，人们也逐渐认可了其与氨氧化细菌相同的功能。
贺纪正等近来对农田土壤生态系统中氨氧化细菌和氨氧化古菌的丰度、组成及对环境的响应进行了一系列研究，取得重要进展 [1113]。由于环境中绝大多数氨氧化微生物都是难培养的，所以传统的可培养方法已经满足不了氨氧化物定量分析的要求。在分子生物技术发展的大背景下，分子生物技术的发展极大地扩展了氨氧化微生物的研究领域。在定量方法方面出现了实时荧光定量PCR、荧光原位杂交FISH等手段。而在定性方法方面，有如扩增rDNA 限制性酶切ARDRA、变性梯度凝胶电泳DGGE、和构建环境 16SrRNA基因克隆文库等方法。此外，焦磷酸测序、稳定性同位素核酸探针技术也是目前较前沿的新兴技术。
本试验所用到的定量PCR技术作为氨氧化物定量分析的方法的一种，通常用来研究土壤微生物特定种群的丰度，定量分析土壤总DNA和RNA的提取效率等[1415]。
研究地概况
试验地所在的兰州大学高寒草甸与湿地生态系统定位研究站位于地处黄河第一湾的甘肃省甘南藏族自治州玛曲县境内。该区习惯上被人们称为若尔盖湿地。它不仅是我国最大的高寒沼泽湿地区域，也是黄河最重要的水源补给区，整个源区58%的水量依赖于补给。该区域有“四最”：“一最”为整个青藏高原高寒草地地上部分生物量最高（平均鲜草产量为3 400 kghm2）；“二最”为植物群落物种最为丰富（每平方米60余种）；“三最”为人口最为密集；“四最”为载畜量最高。生态系统研究站建立于此也弥补了青藏高原上现有台站的不足之处。
采样地点为甘肃省玛曲县境内的兰州大学高寒草甸生态系统玛曲野外定位研究站哇乐卡试验点，土壤的主要类型为亚高山草甸土。样地的地理坐标为35°58′ N，101°53′ E，海拔高约3.5 km；年均气温为1.2 ℃，月平均气温最冷月（1月）为10 ℃，最热月（7 月）可达11.7 ℃，年降水量约为620 mm，属高寒湿润气候；年日照时数约2 580 h，霜期大于270天。
实验样地物种丰富，平均每0.25平方米就有2035个物种，地上干生物量达280400 gm2。较典型的优势物种是禾叶嵩草（Kobresia graminifolia Clarke.）、垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）、波伐早熟禾（Poa botryoides Ttin.）和草玉梅（Anemone rivularis BuchHam. ex DC）等。
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