作物秸秆降解菌的筛选及酶活测定
摘要：本文以水稻秸秆为材料进行纤维素降解菌的筛选与分离纯化。试验以滤纸平板和羧甲基纤维素钠培养基为选择培养基，从腐殖质土、长期秸秆还田的土壤、作物秸秆长期堆放处的土壤和以作物秸秆为饲料的畜禽粪便等富含纤维素降解菌的自然环境中筛选具有明显降解作物秸秆纤维素能力的菌群。通过液体发酵培养，采用划线、稀释平板涂布分离纯化出单个菌种，结合所筛选出菌株的木聚糖酶活、CMC-Na酶活以及滤纸酶活的测定，以及滤纸和秸秆的失重的结果来评定菌株的降解能力，最终筛选出细菌2株，并对这2株菌进行16s rDNA测序，鉴定这2株菌。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 样品 2
1.1.2 培养基 2
1.2 方法 2
1.2.1 纤维素降解菌的富集和纯化 2
1.2.2 液体发酵产酶培养 3
1.2.3 初酶液的提取 3
1.2.4秸秆失重测定 3
1.2.5 酶活测定 3
1.2.6细菌基因组DNA提取 3
1.2.7 PCR扩增 3
1.2.8扩增片段的回收 3
2 结果与分析 4
2.1初筛结果 4
2.2 复筛结果 4
2.3秸秆降解试验 5
2.4 酶活测定结果 6
2.5 菌株16S rDNA鉴定 6
2.5.1 细菌基因组DNA提取 7
2.5.2 PCR扩增 7
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
附录 菌种测序序列 12
作物秸秆降解菌的筛选及酶活测定
引言
引言： 中国农作物秸秆资源丰富，据统计每年产生约7.8亿t 左右的秸秆废弃物，秸秆的主要成分是纤维素含量2530%，木质素含量1020%，半纤维含量1525%，其余还有少量的水分、无机盐和糖分[1]。所以它是一种可以被利用的生物资源，如果将
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
它进行生物的处理，一方面减少了因随意焚烧带来的污染物质的排放，对环境保护起到了很大的作用；另一方面，使废弃的物质与能量得到了最大程度的回收与利用[2]。故如何利用多种方式解决作物秸秆的处理问题日渐成为了学者们竞相研究的热点问题。
目前，自然界中的秸秆只有一少部分得到了利用，绝大多数秸秆不仅被白白浪费，而且还造成环境污染。传统上秸秆多作为农村薪材或以堆积、荒烧等形式倾入环境中[3]。现如今国内愈演愈烈的雾霾天气的形成与秸秆的肆意焚烧有密不可分的联系，而与此同时，以玉米、小麦等为代表的秸秆类物质又是一类优质的可利用资源，随着现代农业的不断发展，秸秆资源化利用的途径也越来越多，包括秸秆能源化、秸秆饲料化、秸秆用作工业原料以及用作肥料等[4]。在秸秆资源化的过程中，如何更快更好地降解以纤维素、半纤维素和木质素为主要成分的秸秆则成为了解决这一问题的重点和难点[5]。因此近年来对农作物的秸秆处理问题的研究越来越多。由于作物秸秆组成成分结构的复杂性，不易降解成为生产中的障碍[5]，特别是在以种植业为主的地区，秸秆在短期内不易腐解，加上直接还田影响墒情和耕作，导致废弃和焚烧秸秆的现象遍及广大农村区域，由此引起环境的污染和资源的严重浪费，因此获取高效降解秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂是解决我国严峻秸秆问题技术的关键[7]。
作物秸秆高效利用的关键问题是选育高产优良菌种是提高纤维素酶活力的关键。产纤维素酶的生物种群相当广泛，如细菌、真菌、放线菌及昆虫等，而且同一微生物也可能因为不同的地区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别[8]。因此，各国学者目前仍然在进一步选育优良性能的菌株，特别是一些极端环境下(如高温、广适pH)的高活性纤维素分解菌。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 样品一：紫金山腐木下的枯枝烂叶土壤；样品二：八卦洲明珠肥料厂堆肥处的土壤；样品三：江心洲江边的腐木下的枯枝烂叶土壤。
1.1.2 培养基 无机盐培养基：NaCl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，M gSO47H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 1.0 g，pH 7.07.2。
LB培养基：胰蛋白质胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.07.2。
羧甲基纤维素培养基：CMC 10 g，KH2PO4 2.0 g，(NH4)2SO4 4.0 g，M gSO47H2O 0.5 g，蛋白质胨 10.0 g，琼脂 25.0 g，水 1000 mL，pH 7.07.2。
刚果红纤维素培养基：纤维素粉 1.88 g，KH2PO4 0.5 g，M gSO47H2O 0.25 g，琼脂 30.0 g，明胶 2.0 g，刚果红 2.0 g。
产纤维素酶培养基：Na2HPO412H2O 1.58 g，KH2PO4 0.9 g，NaNO3 1.0 g，KCl 0.5 g， M gSO47H2O 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，水解酪蛋白质 0.5 g，纤维素粉 0.2 %，pH 7.07.2。
CMC琼脂糖培养基：CMC 0.5 %，琼脂糖 1 %，水 1000 mL。
以上培养基均在121 ℃灭菌20 min。
液体产酶培养基：秸秆粉与麸皮质量比按4:1混匀，取2 g加入250 mL三角瓶中，每瓶再加入100 mL Mandels营养液，自然pH值。Mandels营养液：(NH4)2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，尿素0.3 g，MgSO4?7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4?7H2O 7.5 mg，MnSO4?H2O 2.5 mg，ZnSO4 2.0 mg，CoCl2 3.0 mg，水1000 mL。
1.2 方法
1.2.1 纤维素降解菌的富集和纯化
1.2.1.1 富集 称取10 g土壤样品至90 mL无菌水的三角瓶中，在170 r/m摇床振荡2 h后静止30 min，吸取10 mL上清液加入到90 mL富集培养基中于30℃培养3 d（170 r/m），每隔3 d再转接到新的富集培养基，如此重复转接5次。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 样品 2
1.1.2 培养基 2
1.2 方法 2
1.2.1 纤维素降解菌的富集和纯化 2
1.2.2 液体发酵产酶培养 3
1.2.3 初酶液的提取 3
1.2.4秸秆失重测定 3
1.2.5 酶活测定 3
1.2.6细菌基因组DNA提取 3
1.2.7 PCR扩增 3
1.2.8扩增片段的回收 3
2 结果与分析 4
2.1初筛结果 4
2.2 复筛结果 4
2.3秸秆降解试验 5
2.4 酶活测定结果 6
2.5 菌株16S rDNA鉴定 6
2.5.1 细菌基因组DNA提取 7
2.5.2 PCR扩增 7
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
附录 菌种测序序列 12
作物秸秆降解菌的筛选及酶活测定
引言
引言： 中国农作物秸秆资源丰富，据统计每年产生约7.8亿t 左右的秸秆废弃物，秸秆的主要成分是纤维素含量2530%，木质素含量1020%，半纤维含量1525%，其余还有少量的水分、无机盐和糖分[1]。所以它是一种可以被利用的生物资源，如果将
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它进行生物的处理，一方面减少了因随意焚烧带来的污染物质的排放，对环境保护起到了很大的作用；另一方面，使废弃的物质与能量得到了最大程度的回收与利用[2]。故如何利用多种方式解决作物秸秆的处理问题日渐成为了学者们竞相研究的热点问题。
目前，自然界中的秸秆只有一少部分得到了利用，绝大多数秸秆不仅被白白浪费，而且还造成环境污染。传统上秸秆多作为农村薪材或以堆积、荒烧等形式倾入环境中[3]。现如今国内愈演愈烈的雾霾天气的形成与秸秆的肆意焚烧有密不可分的联系，而与此同时，以玉米、小麦等为代表的秸秆类物质又是一类优质的可利用资源，随着现代农业的不断发展，秸秆资源化利用的途径也越来越多，包括秸秆能源化、秸秆饲料化、秸秆用作工业原料以及用作肥料等[4]。在秸秆资源化的过程中，如何更快更好地降解以纤维素、半纤维素和木质素为主要成分的秸秆则成为了解决这一问题的重点和难点[5]。因此近年来对农作物的秸秆处理问题的研究越来越多。由于作物秸秆组成成分结构的复杂性，不易降解成为生产中的障碍[5]，特别是在以种植业为主的地区，秸秆在短期内不易腐解，加上直接还田影响墒情和耕作，导致废弃和焚烧秸秆的现象遍及广大农村区域，由此引起环境的污染和资源的严重浪费，因此获取高效降解秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂是解决我国严峻秸秆问题技术的关键[7]。
作物秸秆高效利用的关键问题是选育高产优良菌种是提高纤维素酶活力的关键。产纤维素酶的生物种群相当广泛，如细菌、真菌、放线菌及昆虫等，而且同一微生物也可能因为不同的地区来源、不同的培养条件而使得纤维素酶的成分有很大差别[8]。因此，各国学者目前仍然在进一步选育优良性能的菌株，特别是一些极端环境下(如高温、广适pH)的高活性纤维素分解菌。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品 样品一：紫金山腐木下的枯枝烂叶土壤；样品二：八卦洲明珠肥料厂堆肥处的土壤；样品三：江心洲江边的腐木下的枯枝烂叶土壤。
1.1.2 培养基 无机盐培养基：NaCl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，M gSO47H2O 0.2 g，(NH4)2SO4 1.0 g，pH 7.07.2。
LB培养基：胰蛋白质胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.07.2。
羧甲基纤维素培养基：CMC 10 g，KH2PO4 2.0 g，(NH4)2SO4 4.0 g，M gSO47H2O 0.5 g，蛋白质胨 10.0 g，琼脂 25.0 g，水 1000 mL，pH 7.07.2。
刚果红纤维素培养基：纤维素粉 1.88 g，KH2PO4 0.5 g，M gSO47H2O 0.25 g，琼脂 30.0 g，明胶 2.0 g，刚果红 2.0 g。
产纤维素酶培养基：Na2HPO412H2O 1.58 g，KH2PO4 0.9 g，NaNO3 1.0 g，KCl 0.5 g， M gSO47H2O 0.5 g，酵母提取物 0.5 g，水解酪蛋白质 0.5 g，纤维素粉 0.2 %，pH 7.07.2。
CMC琼脂糖培养基：CMC 0.5 %，琼脂糖 1 %，水 1000 mL。
以上培养基均在121 ℃灭菌20 min。
液体产酶培养基：秸秆粉与麸皮质量比按4:1混匀，取2 g加入250 mL三角瓶中，每瓶再加入100 mL Mandels营养液，自然pH值。Mandels营养液：(NH4)2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，尿素0.3 g，MgSO4?7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4?7H2O 7.5 mg，MnSO4?H2O 2.5 mg，ZnSO4 2.0 mg，CoCl2 3.0 mg，水1000 mL。
1.2 方法
1.2.1 纤维素降解菌的富集和纯化
1.2.1.1 富集 称取10 g土壤样品至90 mL无菌水的三角瓶中，在170 r/m摇床振荡2 h后静止30 min，吸取10 mL上清液加入到90 mL富集培养基中于30℃培养3 d（170 r/m），每隔3 d再转接到新的富集培养基，如此重复转接5次。
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