雌二醇降解菌固定化菌剂的制备及降解特性研究
摘要：雌二醇（E2）是环境中常见的雌激素污染物，其生物去除的研究多处于降解功能菌株纯化培养阶段，降解效果并不理想。本文用海藻酸钠包埋法对一株雌二醇降解菌Rhodococcus sp. JX-2进行固定化，通过正交试验确定了该菌株固定化细胞制备的最优条件，并研究对比了固定化细胞和游离细胞的雌二醇降解性能。研究结果表明最佳固定条件为：海藻酸钠质量分数4%；菌液与海藻酸钠水溶液体积比1:1；二水合氯化钙浓度5%.钙化交联时间6h；降解过程最适温度是30～35℃；最适pH值范围为6.0～8.0；最适条件下能高效降解质量分数为1000 mg·L-1的雌二醇溶液。固定化细胞降解雌二醇性能明显优于游离其细胞，研究结果将为该细菌进一步应用于含雌二醇废水的生物处理和家畜粪便中雌二醇的去除提供重要的技术参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1固定化细胞的制备2
1.2.2雌二醇降解率测定3
1.2.3最佳固定化条件的确定3
1.2.4固定化降解菌对雌二醇的去除效果3
2实验结果与分析4
2.1菌株固定化条件的选择4
2.2.1雌二醇初始浓度对雌二醇降解效果的影响4
2.2.2接种量对雌二醇降解效果的影响5 2.2.3温度对雌二醇降解效果的影响6
2.2.4 pH对雌二醇降解效果的影响7
3讨论7
4结论8
致谢8
参考文献8
图1 固定化菌剂图片3
图2 雌二醇初始浓度对雌二醇降解效果的影响5
图3 接种量对雌二醇降解效果的影响6
图4温度对雌二醇降解效果的影响6
图5 pH对雌二醇降解效果的影响7
表1正交试验各因子水平4
表 2 固定化菌剂去除E2的正交试验结果4
雌二醇降解菌固定化菌剂的制备及降解特性研究
引言
环境雌激素( envi
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
ronmental estrogens) 是对有机生物体维持正常的动态平衡、繁殖、生长等行为有不利影响的环境化学物质，它能对生物体内天然激素的合成、分泌、运输、结合、反应和代谢等行为造成不同程度的干扰，从而影响生物生殖等功能。即使环境中只有少量这类物质，也可能导致各种生物体的性激素分泌量下降、活性减弱、精子数量减少、生殖器官异常、癌症等发病率增加，并影响到各生物的生殖系统、免疫系统和神经系统等[1]。环境雌激素按其来源大致可分为天然雌激素(雌二醇、雌酮、雌三醇等)、植物性雌激素和真菌性雌激素、人工合成的雌激素( 乙炔基雌二醇等)以及环境化学污染物( 农药、表面活性剂、塑料制品等)。天然雌激素属于类固醇物质，主要由人和动物体内卵巢细胞产生。人工合成雌激素既包括类固醇衍生物，也包括结构简单的非甾体激素[2]。
17β雌二醇(E2) 是如今诸多环境雌激素中作用最强的一种，作用强度是其2种代谢产物雌酮(E1) 和雌三醇(E3) 的5～1 000倍， E2 普遍存在于各类环境，环境中E2不易被去除，并易在水体和畜禽粪便中富集，有研究者检测出牛粪中E2 高达107. 95 μgkg － 1[3]，也有研究者检测出北京污水中E2高达67.4 ngL － 1[4]，如何消除水和畜禽粪便中的E2 很受关注。尤其是在水体环境中，因为E2 具有潜在的内分泌干扰作用，而且目前普通的水处理技术难以有效地去除其中的E2，所以人们逐渐重视起使用微生物降解包括E2 在内的甾体雌激素的相关技术。
目前关于E2 的生物去除研究多处于雌激素降解功能菌株纯培养阶段，并且多针对单一污染物，并未应用于自然污水和畜禽粪便。近年来，国内外能降解E2的菌株有
Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas putida、Bacillus subtilis等[5,6,7]。然而由于富集E2 的污水和畜禽粪便成分非常复杂，实验室筛选的功能菌株可能会因不适应环境而使活性受到抑制、与土著微生物竞争处于劣势、难以回收等缺点，在应用中受到限制。而采用固定化包埋微生物技术能弥补以上不足,其具有耐环境冲击、可回收利用、显著提高修复效率等优点，使其成为弥补游离菌株不足的选择，目前已广泛应用于有机污染物的处理。此技术可以使高效的菌体细胞在半透性的高分子聚合物或膜内被包埋，或者是使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，产物与反应物可以出入这些多孔或凝胶膜，但微生物细胞却不易逸出。因而可以提高微生物的浓度，降低微生物流失程度，使微生物抵抗环境改变以及承受有毒物质冲击的能力有所提升。此方法可以保持多酶系统，对细胞活性影响很小，制得的固定化细胞成球的机械强度较高，而且操作较简单[8]。在此种包埋法固定化微生物技术中，最重要的是要确定最适的包埋剂及包埋条件，使固定化过程中，微生物活性丧失少，能固持较高的生物量，同时包埋剂又来源广泛、价格相对合理，且操作过程不繁琐复杂;固定成球后，小球机械强度高，传质性能好，性质稳定等[9]。海藻酸钠是目前研究应用最广的包埋剂之一，采用海藻酸钠制备的小球具有传质性能好、无毒、可被土壤微生物降解的特点[10]，所以本研究采用海藻酸钠为载体材料。
本实验室前期从污水中筛选出一株对雌二醇有高效降解性能的功能菌Rhodococcus sp. JX2以此菌株为材料，海藻酸钠为包埋载体，将其进行固定化包埋。探讨不同包埋条件及制备条件下，固定化小球对雌二醇的去除能力，间接比较这些因素对细胞活性的影响，最终确定雌二醇降解菌的最佳包埋条件。同时对雌二醇初始浓度、接种量、温度、pH值等方面比较了未固定细胞与固定化细胞以及空白小球这三种处理对雌二醇去除效果的影响，为后续生物去除雌二醇试验提供理论依据。
1材料与方法
1.1 实验材料
(1)菌种: 雌二醇降解菌株Rhodococcus sp. JX2由大学土壤有机污染控制与修复研究所实验室分离，保藏于实验室冰箱中。
(2)培养基和主要试剂： LB 培养基与MSM 培养基制备方法参照相关文献[11]。含有E2的MSM 培养基: 800 mgL－ 1E2甲醇溶液过0.22 μm 滤膜除菌，取一定量置于灭菌三角瓶中，待甲醇挥发后加入MSM 培养液，使E2达到实验设计的质量浓度。
E2购自上海阿拉丁试剂有限公司，纯度≥98%。
1.2 试验方法
1.2.1 固定化细胞的制备
将实验菌种接种到液体培养基中，于30℃、150r/min条件下培养l0h，离心，无菌水洗涤并重悬得到10mL浓缩菌液（每次试验调节菌液浓度使其在分光光度计下OD600接近1）。取一定量的浓缩菌液与一定浓度的海藻酸钠溶液于常温下混合，充分搅拌成均匀菌悬液后，用注射器滴入一定浓度的CaC12水溶液中，于4℃钙化交联，得到直径3～4 mm的海藻酸钠凝胶小球，无菌水充分洗涤后，于4℃冰箱保存备用。成球后的固定化菌剂如图1所示。
图1 固定化菌剂图片
Fig1. Photo of bacteriaimmobilized agents
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2试验方法 2
1.2.1固定化细胞的制备2
1.2.2雌二醇降解率测定3
1.2.3最佳固定化条件的确定3
1.2.4固定化降解菌对雌二醇的去除效果3
2实验结果与分析4
2.1菌株固定化条件的选择4
2.2.1雌二醇初始浓度对雌二醇降解效果的影响4
2.2.2接种量对雌二醇降解效果的影响5 2.2.3温度对雌二醇降解效果的影响6
2.2.4 pH对雌二醇降解效果的影响7
3讨论7
4结论8
致谢8
参考文献8
图1 固定化菌剂图片3
图2 雌二醇初始浓度对雌二醇降解效果的影响5
图3 接种量对雌二醇降解效果的影响6
图4温度对雌二醇降解效果的影响6
图5 pH对雌二醇降解效果的影响7
表1正交试验各因子水平4
表 2 固定化菌剂去除E2的正交试验结果4
雌二醇降解菌固定化菌剂的制备及降解特性研究
引言
环境雌激素( envi
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
ronmental estrogens) 是对有机生物体维持正常的动态平衡、繁殖、生长等行为有不利影响的环境化学物质，它能对生物体内天然激素的合成、分泌、运输、结合、反应和代谢等行为造成不同程度的干扰，从而影响生物生殖等功能。即使环境中只有少量这类物质，也可能导致各种生物体的性激素分泌量下降、活性减弱、精子数量减少、生殖器官异常、癌症等发病率增加，并影响到各生物的生殖系统、免疫系统和神经系统等[1]。环境雌激素按其来源大致可分为天然雌激素(雌二醇、雌酮、雌三醇等)、植物性雌激素和真菌性雌激素、人工合成的雌激素( 乙炔基雌二醇等)以及环境化学污染物( 农药、表面活性剂、塑料制品等)。天然雌激素属于类固醇物质，主要由人和动物体内卵巢细胞产生。人工合成雌激素既包括类固醇衍生物，也包括结构简单的非甾体激素[2]。
17β雌二醇(E2) 是如今诸多环境雌激素中作用最强的一种，作用强度是其2种代谢产物雌酮(E1) 和雌三醇(E3) 的5～1 000倍， E2 普遍存在于各类环境，环境中E2不易被去除，并易在水体和畜禽粪便中富集，有研究者检测出牛粪中E2 高达107. 95 μgkg － 1[3]，也有研究者检测出北京污水中E2高达67.4 ngL － 1[4]，如何消除水和畜禽粪便中的E2 很受关注。尤其是在水体环境中，因为E2 具有潜在的内分泌干扰作用，而且目前普通的水处理技术难以有效地去除其中的E2，所以人们逐渐重视起使用微生物降解包括E2 在内的甾体雌激素的相关技术。
目前关于E2 的生物去除研究多处于雌激素降解功能菌株纯培养阶段，并且多针对单一污染物，并未应用于自然污水和畜禽粪便。近年来，国内外能降解E2的菌株有
Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas putida、Bacillus subtilis等[5,6,7]。然而由于富集E2 的污水和畜禽粪便成分非常复杂，实验室筛选的功能菌株可能会因不适应环境而使活性受到抑制、与土著微生物竞争处于劣势、难以回收等缺点，在应用中受到限制。而采用固定化包埋微生物技术能弥补以上不足,其具有耐环境冲击、可回收利用、显著提高修复效率等优点，使其成为弥补游离菌株不足的选择，目前已广泛应用于有机污染物的处理。此技术可以使高效的菌体细胞在半透性的高分子聚合物或膜内被包埋，或者是使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，产物与反应物可以出入这些多孔或凝胶膜，但微生物细胞却不易逸出。因而可以提高微生物的浓度，降低微生物流失程度，使微生物抵抗环境改变以及承受有毒物质冲击的能力有所提升。此方法可以保持多酶系统，对细胞活性影响很小，制得的固定化细胞成球的机械强度较高，而且操作较简单[8]。在此种包埋法固定化微生物技术中，最重要的是要确定最适的包埋剂及包埋条件，使固定化过程中，微生物活性丧失少，能固持较高的生物量，同时包埋剂又来源广泛、价格相对合理，且操作过程不繁琐复杂;固定成球后，小球机械强度高，传质性能好，性质稳定等[9]。海藻酸钠是目前研究应用最广的包埋剂之一，采用海藻酸钠制备的小球具有传质性能好、无毒、可被土壤微生物降解的特点[10]，所以本研究采用海藻酸钠为载体材料。
本实验室前期从污水中筛选出一株对雌二醇有高效降解性能的功能菌Rhodococcus sp. JX2以此菌株为材料，海藻酸钠为包埋载体，将其进行固定化包埋。探讨不同包埋条件及制备条件下，固定化小球对雌二醇的去除能力，间接比较这些因素对细胞活性的影响，最终确定雌二醇降解菌的最佳包埋条件。同时对雌二醇初始浓度、接种量、温度、pH值等方面比较了未固定细胞与固定化细胞以及空白小球这三种处理对雌二醇去除效果的影响，为后续生物去除雌二醇试验提供理论依据。
1材料与方法
1.1 实验材料
(1)菌种: 雌二醇降解菌株Rhodococcus sp. JX2由大学土壤有机污染控制与修复研究所实验室分离，保藏于实验室冰箱中。
(2)培养基和主要试剂： LB 培养基与MSM 培养基制备方法参照相关文献[11]。含有E2的MSM 培养基: 800 mgL－ 1E2甲醇溶液过0.22 μm 滤膜除菌，取一定量置于灭菌三角瓶中，待甲醇挥发后加入MSM 培养液，使E2达到实验设计的质量浓度。
E2购自上海阿拉丁试剂有限公司，纯度≥98%。
1.2 试验方法
1.2.1 固定化细胞的制备
将实验菌种接种到液体培养基中，于30℃、150r/min条件下培养l0h，离心，无菌水洗涤并重悬得到10mL浓缩菌液（每次试验调节菌液浓度使其在分光光度计下OD600接近1）。取一定量的浓缩菌液与一定浓度的海藻酸钠溶液于常温下混合，充分搅拌成均匀菌悬液后，用注射器滴入一定浓度的CaC12水溶液中，于4℃钙化交联，得到直径3～4 mm的海藻酸钠凝胶小球，无菌水充分洗涤后，于4℃冰箱保存备用。成球后的固定化菌剂如图1所示。
图1 固定化菌剂图片
Fig1. Photo of bacteriaimmobilized agents
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