木质纤维素分解菌a.fumigatusz5多糖单加氧酶家族基因克隆与功能研究
摘要：木质纤维素分解是堆肥过程中主要的生化反应，木质纤维素酶活力大小将直接关系到堆肥效率的高低。多糖单加氧酶（PMOs）作为糖苷水解酶家族（GH61）成员之一，在木质纤维素分解过程中发挥了重要作用。本研究拟采用荧光定量PCR方法研究菌株A.fumigatus Z5中GH61家族基因及碳源代谢调控因子creA、aceI、xynl的转录差异；通过构建酵母表达载体，异源表达菌株Z5中pmos基因，经亲和层析纯化获得重组PMOs蛋白并研究其酶学特性；这些研究将详尽的阐明PMOs的功能，揭示催化木质纤维素分解及与木质纤维素酶协同作用提高催化效率的机制，为提高堆肥效率提供理论基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究2
1.2.1 菌株Z5中GH61家族基因的分析2
1.2.2 菌株Z5 不同处理RNA的提取及cDNA的合成2
1.2.3 GH61家族基因的荧光定量3
1.3 菌株Z5 中pmos基因克隆、表达及其酶学特性研究3
1.3.1引物的设计与合成3
1.3.2 PCR扩增3
1.3.3大肠杆菌感受态的制备及转化4
1.3.4毕赤酵母感受态的制备4
1.3.5毕赤酵母表达载体的构建4
1.3.6重组毕赤酵母转化子的筛选及诱导表达4
1.3.7毕赤酵母的电击转化5
2 结果与分析5
2.1 GH61家族基因的分析5
2.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究^6
2.3 菌株Z5 中pmos基因克隆7
2.4 PMO基因GH611，GH615，GH618在毕赤酵母中的表达8
3 讨论 9
3.1 GH61家族基因的分析9
3.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究9
3.3 PMO基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
GH611，GH615，GH618在毕赤酵母中的表达9
3.4 研究材料创新9
3.5 研究方法的创新9
3.6 研究思路创新10
致谢10
参考文献10
木质纤维素分解菌A.fumigatus Z5多糖单加氧酶家族基因克隆与功能研究
引言
引言 PMO早在1950年，就有研究者认为必然有一些未被发现的酶会在木质纤维素的降解中起到非常重要的作用[1](Reese et al.,1950)。这个想法直到2011年才被证实，太瑞斯梭壳孢菌（Thielavia terrestris)的胞外酶液对木质纤维素和传统的糖苷酶底物均无水解作用。但将T.terrestris的发酵液与等量的瑞氏木酶（T. reesei)复合纤维素酶混合后，使复合纤维素酶的总量减少一半仍能保证相同的水解效果。Harris[2]等人通过比较T. reesei和T.terrestris胞外纤维素酶系的差别，找到了3个T. terrestris蛋白，它们可以显著提高纤维素酶对经过预处理的玉米秸秆(pretreated corn stover, PCS)的水解作用(Harris et al., 2010)。这一系列的酶被CAZy 数据(Carbonhydrateactivity enzymes database)划分为糖苷水解酶61家族，因为其中的一个成员具有微弱的内切葡萄糖苷酶的活性。后来更多的研究发现，这些酶实际上具有PMO的活性，因此这些酶并不是真正的糖苷水解酶。之所以仍然把它们归在CAZy分类里是因为它们可以极大的促进传统的纤维素对木质纤维素的降解。
PMO分为两类：PM01和PM02。如图1所示，第一类的PMOs，即PM01，从多糖链葡萄糖单体的C1位置夺取氢原子生产内酯型糖。接着内酯型的糖被转化为醛糖酸。该醛糖酸被酸化之后，可以通过磷酸戊糖途径被代谢。而第二类的PMOs (PM02)从多糖链葡萄糖单体的C4位夺取氢原子生产非还原端被氧化的醛酮糖。两种PMO的催化机制则是相同的。[3]（Beeson et al.,2012）
图2 多糖单加氧酶的分类
Fig.2 The classification of PMOs
为了更好地研究PMO的性质，Harris等人利用MIR(multiple isomorphous replacement)在1.9A分辨率的条件下，得到了来自T. terrestris的GH61E和Thermoascus aurantiacus 的GH61B 的三维结构(Harris et al.,2010)。TtGH61E是一个结构致密的单一结构。该结构是一个含有两个β折叠组成的β三明治结构的纤连蛋白Ⅲ型折叠的变异体。从其整体结构来看，PMO表面没有结合可溶性多糖的大的裂痕、沟壑或者孔洞。GH61家族中高度保守的侧链残基位于β三明治结构的中心，并是离子包埋系统的一部分。值得指出的是，GH61蛋白内并没有大多数已知的糖苷水解酶所具有的保守的酸性残基。最保守的酸性残基，Glu137，是离子包埋系统的一部分，它可以与高度保守Arg135形成离子对。当对Glu137定点诱变为丙氨酸(Ala)后会导致该蛋白完全不再表达。这表明这个盐桥在结构上是非常重要的。
1 材料与方法
1.1 材料
葡萄糖、木聚糖、结晶纤维、稻草秸秆、Buffer RⅠ、Buffer RⅡ、Buffer W1A、Buffer W2、Buffer TE、Mandels盐溶液、Z5菌株、无菌水、大肠杆菌TOP10、CaCI2、毕赤酵母的单菌落、YPD培养基、山梨醇。
1.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究
1．2．1 菌株Z5中GH61家族基因的分析 以菌株Z5的基因组数据为基础，分析菌株Z5中的GH61家族基因，通过比较相关的功能区域，利用NCBI数据库的Blast工具，分析比较了与菌株Z5中GH61家族基因相似度比较高的基因，并分析其功能模块。通过分析菌株Z5中的GH61家族基因的序列，分析其中所有的功能基因的关系。
1．2．2 菌株Z5 不同处理RNA的提取及cDNA的合成 在提RNA之前，研钵和研棒用用蒸馏水洗净，晾干或烘干，用锡箔纸包裹严密，然后121 ℃高温灭菌20分钟。实验所用的乙醇和异丙醇皆用未打开的，采用RNAasefree枪头和离心管（由试剂盒中提供）。
将培养基用灭过菌的纱布过滤得到菌丝体，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。取适量加入到1.5ml离心管。加入400 μl Buffer RⅠ，涡旋振荡。加入150 μl Buffer RⅡ，漩涡振荡1530 s，12,000×g离心5 min。取上清至1.5 ml离心管中，加入250 μl异丙醇，混和均匀。将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6,000×g 离心1 min。弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，制备管中加入500 μl Buffer W1A，12,000×g离心1 min。弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，制备管中加入700 μl Buffer W2,12,000×g离心1 min；以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。 弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。将制备管放入一干净的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加30μl Buffer TE。室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA[4]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究2
1.2.1 菌株Z5中GH61家族基因的分析2
1.2.2 菌株Z5 不同处理RNA的提取及cDNA的合成2
1.2.3 GH61家族基因的荧光定量3
1.3 菌株Z5 中pmos基因克隆、表达及其酶学特性研究3
1.3.1引物的设计与合成3
1.3.2 PCR扩增3
1.3.3大肠杆菌感受态的制备及转化4
1.3.4毕赤酵母感受态的制备4
1.3.5毕赤酵母表达载体的构建4
1.3.6重组毕赤酵母转化子的筛选及诱导表达4
1.3.7毕赤酵母的电击转化5
2 结果与分析5
2.1 GH61家族基因的分析5
2.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究^6
2.3 菌株Z5 中pmos基因克隆7
2.4 PMO基因GH611，GH615，GH618在毕赤酵母中的表达8
3 讨论 9
3.1 GH61家族基因的分析9
3.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究9
3.3 PMO基因
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
GH611，GH615，GH618在毕赤酵母中的表达9
3.4 研究材料创新9
3.5 研究方法的创新9
3.6 研究思路创新10
致谢10
参考文献10
木质纤维素分解菌A.fumigatus Z5多糖单加氧酶家族基因克隆与功能研究
引言
引言 PMO早在1950年，就有研究者认为必然有一些未被发现的酶会在木质纤维素的降解中起到非常重要的作用[1](Reese et al.,1950)。这个想法直到2011年才被证实，太瑞斯梭壳孢菌（Thielavia terrestris)的胞外酶液对木质纤维素和传统的糖苷酶底物均无水解作用。但将T.terrestris的发酵液与等量的瑞氏木酶（T. reesei)复合纤维素酶混合后，使复合纤维素酶的总量减少一半仍能保证相同的水解效果。Harris[2]等人通过比较T. reesei和T.terrestris胞外纤维素酶系的差别，找到了3个T. terrestris蛋白，它们可以显著提高纤维素酶对经过预处理的玉米秸秆(pretreated corn stover, PCS)的水解作用(Harris et al., 2010)。这一系列的酶被CAZy 数据(Carbonhydrateactivity enzymes database)划分为糖苷水解酶61家族，因为其中的一个成员具有微弱的内切葡萄糖苷酶的活性。后来更多的研究发现，这些酶实际上具有PMO的活性，因此这些酶并不是真正的糖苷水解酶。之所以仍然把它们归在CAZy分类里是因为它们可以极大的促进传统的纤维素对木质纤维素的降解。
PMO分为两类：PM01和PM02。如图1所示，第一类的PMOs，即PM01，从多糖链葡萄糖单体的C1位置夺取氢原子生产内酯型糖。接着内酯型的糖被转化为醛糖酸。该醛糖酸被酸化之后，可以通过磷酸戊糖途径被代谢。而第二类的PMOs (PM02)从多糖链葡萄糖单体的C4位夺取氢原子生产非还原端被氧化的醛酮糖。两种PMO的催化机制则是相同的。[3]（Beeson et al.,2012）
图2 多糖单加氧酶的分类
Fig.2 The classification of PMOs
为了更好地研究PMO的性质，Harris等人利用MIR(multiple isomorphous replacement)在1.9A分辨率的条件下，得到了来自T. terrestris的GH61E和Thermoascus aurantiacus 的GH61B 的三维结构(Harris et al.,2010)。TtGH61E是一个结构致密的单一结构。该结构是一个含有两个β折叠组成的β三明治结构的纤连蛋白Ⅲ型折叠的变异体。从其整体结构来看，PMO表面没有结合可溶性多糖的大的裂痕、沟壑或者孔洞。GH61家族中高度保守的侧链残基位于β三明治结构的中心，并是离子包埋系统的一部分。值得指出的是，GH61蛋白内并没有大多数已知的糖苷水解酶所具有的保守的酸性残基。最保守的酸性残基，Glu137，是离子包埋系统的一部分，它可以与高度保守Arg135形成离子对。当对Glu137定点诱变为丙氨酸(Ala)后会导致该蛋白完全不再表达。这表明这个盐桥在结构上是非常重要的。
1 材料与方法
1.1 材料
葡萄糖、木聚糖、结晶纤维、稻草秸秆、Buffer RⅠ、Buffer RⅡ、Buffer W1A、Buffer W2、Buffer TE、Mandels盐溶液、Z5菌株、无菌水、大肠杆菌TOP10、CaCI2、毕赤酵母的单菌落、YPD培养基、山梨醇。
1.2 菌株Z5中GH61家族基因的表达特征研究
1．2．1 菌株Z5中GH61家族基因的分析 以菌株Z5的基因组数据为基础，分析菌株Z5中的GH61家族基因，通过比较相关的功能区域，利用NCBI数据库的Blast工具，分析比较了与菌株Z5中GH61家族基因相似度比较高的基因，并分析其功能模块。通过分析菌株Z5中的GH61家族基因的序列，分析其中所有的功能基因的关系。
1．2．2 菌株Z5 不同处理RNA的提取及cDNA的合成 在提RNA之前，研钵和研棒用用蒸馏水洗净，晾干或烘干，用锡箔纸包裹严密，然后121 ℃高温灭菌20分钟。实验所用的乙醇和异丙醇皆用未打开的，采用RNAasefree枪头和离心管（由试剂盒中提供）。
将培养基用灭过菌的纱布过滤得到菌丝体，转移至预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末。取适量加入到1.5ml离心管。加入400 μl Buffer RⅠ，涡旋振荡。加入150 μl Buffer RⅡ，漩涡振荡1530 s，12,000×g离心5 min。取上清至1.5 ml离心管中，加入250 μl异丙醇，混和均匀。将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，转移步骤4中的混合液到制备管中，6,000×g 离心1 min。弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，制备管中加入500 μl Buffer W1A，12,000×g离心1 min。弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，制备管中加入700 μl Buffer W2,12,000×g离心1 min；以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。 弃滤液，将制备管置回到2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。将制备管放入一干净的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加30μl Buffer TE。室温静置1min，12,000×g离心1min，洗脱得RNA[4]。
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