多环芳烃污染菜地土壤细菌双加氧酶基因特征研究
摘要：多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是一类具有“三致”效应的持久性有机污染物。美国EPA列出的优先控制多环芳烃有16种，这16种物质根据其组成及环数的不同，其所具有的性质和危害也各不相同。PAHs是主要的土壤污染物，在目前的土壤修复工程中，多环芳烃降解依然是一项重、难点问题；就目前而言，通过土壤微生物进行修复是一种易于操作并行之有效的方法。本研究选取南京郊区某典型多环芳烃污染菜地土壤，开展了以下工作：测定了土壤中细菌多环芳烃双加氧酶基因数量及多样性，发现在该污染高风险区土壤中普遍存在革兰氏阳性菌PAHs双加氧酶基因，但未检出革兰氏阴性菌PAHs双加氧酶基因。革兰氏阳性菌PAHs双加氧酶基因片段主要与Terrabacter sp.FLO、Mycobacterium gilvum Spyr1及M.vanbaalenii PYR-1相近，属于 nidA3B3类群；基因丰度与多样性和土壤污染水平没有明显相关性。选取污染土壤，建立实验室培养微域，通过人工添加蒽、苯并[a]蒽和苯并[a]芘，研究PAHs胁迫下土壤微生物的响应。结果显示，与不加PAHs的对照相比，细菌、古菌及革兰氏阳性菌PAHs双加氧酶的的丰度变化不大。这些结果有助于了解污染高风险地区菜地土壤中的PAHs降解菌资源及其对PAHs污染物的响应，并为针对性调控土壤微生物PAHs降解能力提供依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
第一部分 污染菜地土壤多环芳烃双加氧酶基因丰度及多样性研究2
1 材料与方法2
1.1 供试土壤2
1.2 试剂3
1.3 培养基的制备3
1.4 方法 3
1.4.1 梅山菜地土壤DNA的提取3
1.4.2 PCR扩增梅山菜地土壤革兰氏阳性菌双加氧酶基因4
1.4.2 多环芳烃双加氧酶对不同PAHs的响应4
1.4.3 PAHs双加氧酶基因的克隆测序4
1.4.4 序列分析及系统发育树构建4
2结果与分析 4
2.1PCR扩增梅
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
山菜地土壤革兰氏阳性菌双加氧酶基因4
2.1.1基因的筛选与送检 5
2.1.2基因树的构建 6第二部分 土壤微生物对多环芳烃污染物的响应研究 7
1.4.5 多环芳烃双加氧酶对不同PAHs的响应7
2.2 典型污染菜地土壤中革兰氏阳性菌双加氧酶基因的丰度和多样性7
2.3 土壤微生物对不同PAHs的响应 8
3 讨论 9
3.1 PCR扩增梅山菜地土壤革兰氏阳性菌双加氧酶基因9
3.2土壤微生物对不同PAHs的响应 9
致谢 10
参考文献 10 多环芳烃污染菜地土壤细菌双加氧酶基因特征研究
引言
引言
PAHs由于其潜在的致癌、致畸和致突变性越来越受到广泛关注，它们主要通过煤、石油、木材以及一些高分子有机化合物不完全燃烧所致。由于PAHs具有较强的疏水性，其在环境中容易吸附于土壤颗粒，而不利于生物降解。
环境中大部分多环芳烃的降解是通过土壤中的多环芳烃降解菌来完成的。近10年来，多环芳烃的生物降解及其降解酶系的研究已成为环境领域关注的热点。目前已知的双加氧酶约为40种，根据其开环方式的不同，大体可分为两类：环羟基化双加氧酶和环断裂化双加氧酶。经过国内外科研人员的不断探索，双加氧酶的相关研究已深入到反应机理的研究、光学活性物质的获得、双加氧酶结构与功能的研究及其分子生物学改造，相关基因结构、起源与高表达等领域。
前期研究基础显示，南京市郊某钢铁冶炼企业周边的土壤，由于工业活动排放的影响，土壤中PAHs的含量较高。但是，目前对该区域土壤中多环芳烃降解菌的种类、数量的了解还十分有限。本研究研究通过对多环芳烃双加氧酶基因特征的解析，系统调查该高风险区的土壤降解菌资源，并通过微域培养评价土壤微生物对高浓度PAHs的响应，旨在开发土壤中的PAHs降解菌资源，为土壤污染修复提供有效技术支撑。
第一部分 污染菜地土壤多环芳烃双加氧酶基因丰度及多样性研究
1 材料与方法
1.1 供试土壤
土壤样品采自江苏省南京市梅山钢铁工业园附近PAHs污染农田土壤（510cm）。土壤样品运回实验室后，一部分储存于20°C冰箱，一部分经风干、磨细、过筛后，用于理化性质分析。
土壤基本理化性质：
pH、全氮、全碳、C/N等理化性质和土壤中多环芳烃污染物含量（根据实验设计，具体为蒽、苯并a蒽、苯并a芘）详见表1；用于土壤PAHs降解实验的土壤去除植物残体、风干后，研磨过1mm筛并储存于4℃以备用。
表1.土壤试样理化性质和PAHs污染物含量
技术编号
全氮（%）
全碳（%）
C:N
pH
蒽（ng/kg）
苯并(a)蒽(ng/kg)
苯并(a)芘(ng/kg)
14
0.0646
0.729
11.28
8.43
3.9
41.5
53.2
15
0.147
1.43
9.73
6.16
23.0
220.7
279.5
16
0.159
1.77
11.13
6.69
57.1
493.8
619.3
17
0.16
1.71
10.69
5.77
20.6
219.7
294.3
18
0.139
1.52
10.94
7.05
54.4
481.1
636.9
19
0.189
1.97
10.42
6.75
84.2
448.0
547.2
20
0.135
1.35
10.00
6.86
29.4
226.0
298.8
21
0.128
1.32
10.31
6.29
12.3
131.7
187.4
22
0.0923
0.836
9.06
8.31
7.4
66.4
86.2
29
0.228
2.27
9.96
6.56
27.0
214.2
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
第一部分 污染菜地土壤多环芳烃双加氧酶基因丰度及多样性研究2
1 材料与方法2
1.1 供试土壤2
1.2 试剂3
1.3 培养基的制备3
1.4 方法 3
1.4.1 梅山菜地土壤DNA的提取3
1.4.2 PCR扩增梅山菜地土壤革兰氏阳性菌双加氧酶基因4
1.4.2 多环芳烃双加氧酶对不同PAHs的响应4
1.4.3 PAHs双加氧酶基因的克隆测序4
1.4.4 序列分析及系统发育树构建4
2结果与分析 4
2.1PCR扩增梅
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
山菜地土壤革兰氏阳性菌双加氧酶基因4
2.1.1基因的筛选与送检 5
2.1.2基因树的构建 6第二部分 土壤微生物对多环芳烃污染物的响应研究 7
1.4.5 多环芳烃双加氧酶对不同PAHs的响应7
2.2 典型污染菜地土壤中革兰氏阳性菌双加氧酶基因的丰度和多样性7
2.3 土壤微生物对不同PAHs的响应 8
3 讨论 9
3.1 PCR扩增梅山菜地土壤革兰氏阳性菌双加氧酶基因9
3.2土壤微生物对不同PAHs的响应 9
致谢 10
参考文献 10 多环芳烃污染菜地土壤细菌双加氧酶基因特征研究
引言
引言
PAHs由于其潜在的致癌、致畸和致突变性越来越受到广泛关注，它们主要通过煤、石油、木材以及一些高分子有机化合物不完全燃烧所致。由于PAHs具有较强的疏水性，其在环境中容易吸附于土壤颗粒，而不利于生物降解。
环境中大部分多环芳烃的降解是通过土壤中的多环芳烃降解菌来完成的。近10年来，多环芳烃的生物降解及其降解酶系的研究已成为环境领域关注的热点。目前已知的双加氧酶约为40种，根据其开环方式的不同，大体可分为两类：环羟基化双加氧酶和环断裂化双加氧酶。经过国内外科研人员的不断探索，双加氧酶的相关研究已深入到反应机理的研究、光学活性物质的获得、双加氧酶结构与功能的研究及其分子生物学改造，相关基因结构、起源与高表达等领域。
前期研究基础显示，南京市郊某钢铁冶炼企业周边的土壤，由于工业活动排放的影响，土壤中PAHs的含量较高。但是，目前对该区域土壤中多环芳烃降解菌的种类、数量的了解还十分有限。本研究研究通过对多环芳烃双加氧酶基因特征的解析，系统调查该高风险区的土壤降解菌资源，并通过微域培养评价土壤微生物对高浓度PAHs的响应，旨在开发土壤中的PAHs降解菌资源，为土壤污染修复提供有效技术支撑。
第一部分 污染菜地土壤多环芳烃双加氧酶基因丰度及多样性研究
1 材料与方法
1.1 供试土壤
土壤样品采自江苏省南京市梅山钢铁工业园附近PAHs污染农田土壤（510cm）。土壤样品运回实验室后，一部分储存于20°C冰箱，一部分经风干、磨细、过筛后，用于理化性质分析。
土壤基本理化性质：
pH、全氮、全碳、C/N等理化性质和土壤中多环芳烃污染物含量（根据实验设计，具体为蒽、苯并a蒽、苯并a芘）详见表1；用于土壤PAHs降解实验的土壤去除植物残体、风干后，研磨过1mm筛并储存于4℃以备用。
表1.土壤试样理化性质和PAHs污染物含量
技术编号
全氮（%）
全碳（%）
C:N
pH
蒽（ng/kg）
苯并(a)蒽(ng/kg)
苯并(a)芘(ng/kg)
14
0.0646
0.729
11.28
8.43
3.9
41.5
53.2
15
0.147
1.43
9.73
6.16
23.0
220.7
279.5
16
0.159
1.77
11.13
6.69
57.1
493.8
619.3
17
0.16
1.71
10.69
5.77
20.6
219.7
294.3
18
0.139
1.52
10.94
7.05
54.4
481.1
636.9
19
0.189
1.97
10.42
6.75
84.2
448.0
547.2
20
0.135
1.35
10.00
6.86
29.4
226.0
298.8
21
0.128
1.32
10.31
6.29
12.3
131.7
187.4
22
0.0923
0.836
9.06
8.31
7.4
66.4
86.2
29
0.228
2.27
9.96
6.56
27.0
214.2
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