凹土基贫营养微生物制剂的制备与性能研究
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2国内外研究进展情况 1
1.3本课题研究的意义 3
2 实验材料和实验方法 3
2.1 实验主要仪器 4
2.2 实验主要试剂 4
2.3 实验方法 5
3 实验结果与讨论. 9
3.1 贫营养细菌培养 10
3.2 复凝聚法制备微胶囊. 12
3.3 微胶囊的性能研究 22
结论 27
致谢 28
参考文献 29
1 绪论
1.1 研究背景
贫营养细菌又称为寡营养细菌，是指在含碳1~15mg/L培养基中并且是第一次培养时能够生长的细菌。兼性贫营养细菌是指能够在富培养基和贫营养基中良好地适应并生长的细菌。
贫营养细菌的培养特性可以大致划分为4类：(1)某类细菌在初次分离时，仅能在营养匮乏的培养基上培养的；(2)仅仅能在特殊的营养匮乏的培养基上生长的细菌；(3)第一次分离时能在营养匮乏的培养基上培养，之后也能在营养丰富的培养基上培养的细菌；(4)在实验室中现在还无法培养，但在电子显微镜下可以观测到的细菌。
随着人类对自然资源的开发和利用,国民经济的日益发展，我国饮用水水源的微污染问题日益严峻，常规的混凝过滤净水工艺难以保障水质达标，所以筛选高效贫营养微生物对饮用水进行深度处理已成为净水工艺研究领域的重要分支。凹土是一种具有独特结构的且吸附性能良好的粘土矿物，使用成本低，已被广泛应用在廉价吸附剂在各种污、废水处理的探索中。在凹土基的基础上，将鉴定出的高效贫营养微生物进行复配，研发贫营养微生物制剂，使其抗酸碱性大大提高，稳定性增加，保存菌种的活 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
性，从而能把污染降低到更低的水平。
1.2 国内外研究进展情况
1.2.1 贫营养微生物研究发展
由于地球上营养贫瘠的环境越来越普遍，贫营养微生物作为一种新兴的研究材料便被广泛研究[2]。国内学者取得了较多的研究成果，如华中科技大学的夏辉等分离出的38株贫营养细菌是在不同的环境中分离的。将它们进行16S rDNA序列分析，结果表明它们主要分为18个属，比如不动杆菌属(Acinetobacter)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)等。从这其中筛选出一株菌株，分别采用化学需氧量(CODMn)和总有机碳(TOC)对其进行检测，得到性能优良的菌株Y11[1]；利用闪烁计数器和放射性凝胶电泳技术进行贫营养细菌的生理生态方面的研究；利用混合菌等技术来使微污染水体中的氮磷得到大量地去除，从而达到治理污染水体的目的[2]；周石磊、黄廷林等结合周娜等分离的ZN1、ZN2和ZN3，使得实验结束时的硝酸盐氮去除率达到80%以上，同时证明静水压不利于好氧脱氮反硝化的脱氮过程。这方面的研究将使贫营养细菌能够被更广泛地应用于微污染水体的治理起到很好的助推作用[3]。
1.2.2 微生物制剂的制备及进展
微生物制剂又名微生态调节剂、益生菌、活菌剂、EM菌制剂等。微生物制剂的制备方法主要有冻干法、微胶囊法等。
制备微生物制剂的主要生产工艺之一就是冷冻干燥技术，该技术的优点主要是以下几点：一是能够使产品原有的理化性质和生物活性不因物理化学过程而发生变化，有效成分保存率高。二是干燥后的产品的理化指标具有很好的均一性。三是产品既能够长期保存又能够在加水后迅速完全溶解。但冻干有几点缺点：溶剂的可选择性差，可制备的晶型有限，在某些晶型的制备方面还存在困难，冻干不但存在时间长的问题，而且还浪费大量的时间精力，制作成本高[4]。
微胶囊技术是指利用高分子材料，将一些具有活性或者挥发性的固液气状物体进行包裹，形成半透性或者密封性的囊状微小粒子的一种新兴技术，能够改善物料的质量和体积以及保护敏感性成分、控制芯材的释放。近几年来,微囊技术被广泛应用于医疗、水处理、化工业、食品等各个方面的固定化[5]。
微胶囊的制备方法总的来说主要有三大类，分别为物理法、化学法、物理化学法。其中物理法主要包括空气悬浮法、挤压法、锅包法和气相沉积法等; 化学法有复凝聚法、界面聚合法、锐孔－凝固浴法和乳化法等; 物理化学法主要包括相分离法、粉末床法和干燥浴法等。近年来还出现了制备纳米微胶囊的许多新的制备方法，如超微胶囊技术、乳液聚合法等[6]。
复凝聚法是物理化学法中被广泛应用的一种制备微胶囊的方法。该方法的壁材常采用明胶-阿拉伯胶组合，交联剂常采用甲醛和戊二醛，但因这两种交联剂均有毒性，对微生物有一定的杀伤力，所以使该技术不能很好地被应用于各个领域。明胶胶原水解时有三条螺旋就会彼此拆开，肽链发生分离和断裂后，从而形成了分子量较小的明胶[7]。阿拉伯胶是一种天然的大分子多糖，呈弱酸性，溶解度高，乳化性能稳定，是用复凝聚法制备微胶囊的良好壁材之一。
用复凝聚法制备微胶囊在国内外进行了广泛的研究应用。包清衫等将液体香精加工成缓释性固体粉末香精，用复凝聚法制备液体香精微胶囊，优 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
化正交试验，最终成功验证了所包埋的微胶囊仍然有良好的缓释效果。Helliwell H.等人通过采用碳二亚氨对经戊二醛交联和未交联的明胶一阿拉伯树胶微胶囊进行表面处理，改变其表面的狡基数量，为使微胶囊和动物的粘液相结合，采用聚丙烯酸来达到目的，结果表明结合的情况被大大地改善；Weinbreck 等制备桔油微胶囊采用了以乳清蛋白和阿拉伯胶为壁材的复凝聚法，以优化微胶囊的制备工艺[8]。姚建国在肉豆蔻酸异丙酯加入丹参酮使其溶解，然后分别选择明胶－阿拉伯胶和甲醛为壁材和固化剂，用复合凝聚法对其进行了微胶囊化，研究不同的反应条件对微胶囊化产生的各种影响，微胶囊的粒度分布的改善主要受表面活性剂和搅拌速度的影响，制备得到的微胶囊产品包埋率可达80%以上[9]。王锦成等制备医用纳米级辣椒素微胶囊[10] ，采用单凝聚法，通过分别选取明胶、无水乙醇、戊二醛和单宁酸为壁材，凝聚剂使和交联固化剂；陈晓昱等为改善辣椒素的溶解性，结合现有技术，利用羟丙基-β-环糊精制备了辣椒素包合物[11]。FernandaV.Leimann等将实验壁材选用为聚乙烯和戊二醛交联的聚合物，通过单凝聚法制备柠檬草精油微胶囊，证实所得到的微胶囊仍然具有广谱的抗菌活性。GEOK-LAY KOH[12] 为了能够对微胶囊制备的最佳工艺条件的适用性进行预测，通过研究对CMC-明胶复合凝聚体系中的胶体粘度、浊度、湿重以及体积进行表征，得出了如下实验结果：四个因素中，只有浊度表征法具有普遍的适用性；而对于胶体粘度则只有使其在合适的PH内才会有效；湿重和体积不适合作表征手段，因为他们会随着混合胶比的改变而随之改变。华中农业大学王青松实验净水实验的研究也表明获得的载菌微胶囊性能良好，纱布等介质的使用，使得载菌胶囊体系的稳定性有了进一步的提高，在一定程度上也使载菌微胶囊体系的应用范围得到进一步的扩展，为净水提供了行之有效的方法。
革兰氏染色液 牛肉膏 大豆蛋白胨 NaCl NaOH 琼脂粉 明胶 生理盐水 Tween-80 EM菌 浓盐酸 阿拉伯胶 戊二醛 磷酸二氢钾 磷酸氢二钾 —— 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 —— 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 杭州天和微生物试剂有限公司 宜兴市永信生物有限公司 宜兴市永信生物有限公司 无锡市亚盛化工有限公司 南京化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 —— 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 —— 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司
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1.1 研究背景 1
1.2国内外研究进展情况 1
1.3本课题研究的意义 3
2 实验材料和实验方法 3
2.1 实验主要仪器 4
2.2 实验主要试剂 4
2.3 实验方法 5
3 实验结果与讨论. 9
3.1 贫营养细菌培养 10
3.2 复凝聚法制备微胶囊. 12
3.3 微胶囊的性能研究 22
结论 27
致谢 28
参考文献 29
1 绪论
1.1 研究背景
贫营养细菌又称为寡营养细菌，是指在含碳1~15mg/L培养基中并且是第一次培养时能够生长的细菌。兼性贫营养细菌是指能够在富培养基和贫营养基中良好地适应并生长的细菌。
贫营养细菌的培养特性可以大致划分为4类：(1)某类细菌在初次分离时，仅能在营养匮乏的培养基上培养的；(2)仅仅能在特殊的营养匮乏的培养基上生长的细菌；(3)第一次分离时能在营养匮乏的培养基上培养，之后也能在营养丰富的培养基上培养的细菌；(4)在实验室中现在还无法培养，但在电子显微镜下可以观测到的细菌。
随着人类对自然资源的开发和利用,国民经济的日益发展，我国饮用水水源的微污染问题日益严峻，常规的混凝过滤净水工艺难以保障水质达标，所以筛选高效贫营养微生物对饮用水进行深度处理已成为净水工艺研究领域的重要分支。凹土是一种具有独特结构的且吸附性能良好的粘土矿物，使用成本低，已被广泛应用在廉价吸附剂在各种污、废水处理的探索中。在凹土基的基础上，将鉴定出的高效贫营养微生物进行复配，研发贫营养微生物制剂，使其抗酸碱性大大提高，稳定性增加，保存菌种的活 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
性，从而能把污染降低到更低的水平。
1.2 国内外研究进展情况
1.2.1 贫营养微生物研究发展
由于地球上营养贫瘠的环境越来越普遍，贫营养微生物作为一种新兴的研究材料便被广泛研究[2]。国内学者取得了较多的研究成果，如华中科技大学的夏辉等分离出的38株贫营养细菌是在不同的环境中分离的。将它们进行16S rDNA序列分析，结果表明它们主要分为18个属，比如不动杆菌属(Acinetobacter)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)等。从这其中筛选出一株菌株，分别采用化学需氧量(CODMn)和总有机碳(TOC)对其进行检测，得到性能优良的菌株Y11[1]；利用闪烁计数器和放射性凝胶电泳技术进行贫营养细菌的生理生态方面的研究；利用混合菌等技术来使微污染水体中的氮磷得到大量地去除，从而达到治理污染水体的目的[2]；周石磊、黄廷林等结合周娜等分离的ZN1、ZN2和ZN3，使得实验结束时的硝酸盐氮去除率达到80%以上，同时证明静水压不利于好氧脱氮反硝化的脱氮过程。这方面的研究将使贫营养细菌能够被更广泛地应用于微污染水体的治理起到很好的助推作用[3]。
1.2.2 微生物制剂的制备及进展
微生物制剂又名微生态调节剂、益生菌、活菌剂、EM菌制剂等。微生物制剂的制备方法主要有冻干法、微胶囊法等。
制备微生物制剂的主要生产工艺之一就是冷冻干燥技术，该技术的优点主要是以下几点：一是能够使产品原有的理化性质和生物活性不因物理化学过程而发生变化，有效成分保存率高。二是干燥后的产品的理化指标具有很好的均一性。三是产品既能够长期保存又能够在加水后迅速完全溶解。但冻干有几点缺点：溶剂的可选择性差，可制备的晶型有限，在某些晶型的制备方面还存在困难，冻干不但存在时间长的问题，而且还浪费大量的时间精力，制作成本高[4]。
微胶囊技术是指利用高分子材料，将一些具有活性或者挥发性的固液气状物体进行包裹，形成半透性或者密封性的囊状微小粒子的一种新兴技术，能够改善物料的质量和体积以及保护敏感性成分、控制芯材的释放。近几年来,微囊技术
微胶囊的制备方法总的来说主要有三大类，分别为物理法、化学法、物理化学法。其中物理法主要包括空气悬浮法、挤压法、锅包法和气相沉积法等; 化学法有复凝聚法、界面聚合法、锐孔－凝固浴法和乳化法等; 物理化学法主要包括相分离法、粉末床法和干燥浴法等。近年来还出现了制备纳米微胶囊的许多新的制备方法，如超微胶囊技术、乳液聚合法等[6]。
复凝聚法是物理化学法中被广泛应用的一种制备微胶囊的方法。该方法的壁材常采用明胶-阿拉伯胶组合，交联剂常采用甲醛和戊二醛，但因这两种交联剂均有毒性，对微生物有一定的杀伤力，所以使该技术不能很好地被应用于各个领域。明胶胶原水解时有三条螺旋就会彼此拆开，肽链发生分离和断裂后，从而形成了分子量较小的明胶[7]。阿拉伯胶是一种天然的大分子多糖，呈弱酸性，溶解度高，乳化性能稳定，是用复凝聚法制备微胶囊的良好壁材之一。
用复凝聚法制备微胶囊在国内外进行了广泛的研究应用。包清衫等将液体香精加工成缓释性固体粉末香精，用复凝聚法制备液体香精微胶囊，优 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
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