以凹叶厚朴为培养材料对其内生真菌代谢产物含量的研究(附件)
摘 要凹叶厚朴是一种濒临灭绝的珍贵药用植物，具有多种药理活性，由于内生真菌的代谢产物中含有与宿主植物相同或相似的有效成分。中药炮制与微生物发酵存在着密切的联系。本文构思利用中药炮制与微生物发酵的关系，以凹叶厚朴植物的叶、皮为培养基成分，培养凹叶厚朴中的内生真菌，利用微生物对中药的生物转化作用，提高内生真菌代谢产物的含量。本实验在基础培养基的基础上，分别加入凹叶厚朴植物的叶、皮，培养凹叶厚朴内生真菌，对加入凹叶厚朴皮、叶发酵液中的有效成分进行提取，以厚朴酚对照为标准，用高效液相测定加入凹叶厚朴叶、皮培养后内生真菌代谢产物的含量。液相条件：色谱柱DiamonsilC18(4.6×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(78:22)；流速：1.0 ml/min；柱温：25°C；检测波长294 nm；进样体积10 μl。结果表明：其中未加凹叶厚朴叶、皮培养的内生真菌YX-24号含量为0.00325 mg/g、0.00521 mg/g。加入凹叶厚朴叶、皮材料，培养内生真菌YX-24号，所得含量为0.011 mg/g、0.018 mg/g。与普通的培养方法进行比较，发现加入凹叶厚朴药材的培养基对其内生真菌有促进作用，增加了代谢产物的产量。再次证明了，中药对微生物的代谢产物有促进作用。解决了凹叶厚朴中有效成分低的问题。由于加入叶、皮等材料后提高了内生真菌代谢产物的含量，期望可以更深入的研究中药炮制与微生物的关系，适当缓解药源短缺的问题。目 录
1 文献综述
1.1 植物简介 1
1.2 凹叶厚朴中的成分 1
1.2.1 凹叶厚朴的主要成分 1
1.2.2 其他 2
1.3 内生真菌 2
1.4 内生真菌与宿主的关系 2
1.5 内生真菌的产生 3
1.6 中药与内生真菌的关系 3
1.7 小结 4
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 实验仪器 5
2.1.3 材料及试剂 5
2.1.4 培养基的配制 6
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种
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1.6 中药与内生真菌的关系 3
1.7 小结 4
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 实验仪器 5
2.1.3 材料及试剂 5
2.1.4 培养基的配制 6
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种复壮 6
2.2.2 固体发酵培养 6
2.2.3 液体发酵培养 7
2.2.4 发酵液的提取 7
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
2.3.2 色谱条件 7
2.3.3 实验方法 7
2.4 结果与分析 8
2.4.1 线性关系 8
2.4.2 实验结果分析 9
结论 12
参考文献 13
致谢 15
文献综述
植物简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)是我国的珍贵药用树种，为木兰科。年份高的凹叶厚朴树全身皆可入药，有非常高的药用价值。主要生长在陕西南部、甘肃东南部、河南东南部、湖北西部、四川中部、贵州东北部[1]。凹叶厚朴为厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)的一个亚种，两者不同之处在于凹叶厚朴的叶先端凹缺，其他形态特征均相同。厚朴与凹叶厚朴生长环境与习性均相同，所以二者总是交错生长。凹叶厚朴其性温，味苦、辛；主治：燥湿消痰，下气除满。用于湿滞伤中，脘痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳[2]。临床多用来治疗细菌感染，炎症和胃肠道疾病等[3]。厚朴还是中国药典2015年版一部中许多丸剂或者一些治疗肝疾病药物的一些复方制剂的原材料[1]。凹叶厚朴的主要成分厚朴酚与和厚朴酚。由于凹叶厚朴对生长条件的要求较高，本来可以供其生长的地方就不是很多，而生长在温热、湿润气候的厚朴品质最佳。树木生长迟缓，而药用最多的树皮又恢复缓慢。由于凹叶厚朴在中药制剂中起到的作用越来越高，需求越来越大，目前可利用的野生资源较少，因此先后被列为国家二级保护中药材和国家二级保护植物[4]。种植的由于生长的地理位置不是最佳的生长环境所以质量得不到保障，故其资源日渐减少，供需矛盾日益突出。寻找新的途径和研究方法迫在眉睫。
凹叶厚朴中的成分
凹叶厚朴的主要成分
厚朴酚(Magnolol,MN)与和厚朴酚(Honokiol,HN)为二聚苯丙素类化合物，生活在十九世纪时代的学者藤田等先后逐渐从收集采购的植物厚朴中提取精分出了大量异构体成分，并从中论证了其原理与关系[5]。越来越多的人针对厚朴酚进行试验探讨，发现了其具有的很多功效，它不仅能够抑制氧化，还能为人类心理健康作出贡献，对社会人类身体带来的危险疾病也可发挥功用，其含有的活性程度很高[68]。虽然在某些领域的确表现出良好的临床疗效，但是若要推广或者要得到国内外学者们更高程度的认可，还需要对其单体做更深层次的基础及临床试验[9]。和厚朴酚具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[10]。
其他
厚朴除含有的有效成分除了挥发油、生物碱等成分外，还含有多种利用价值高的物质，它们占有的比例大约有百分之五左右，具有较强烈的活性[11]，除此之外，还含有许多羟基类物质或者大量不同形态和性质的酚类成分，可能还存在其他结构[12]。
内生真菌
植物内生真菌(Plant endophytic fungi)是指那些在特定环境状态下能在某一时期生存下来的或者终其一生都能在拥有强烈生机的宿主体内存活下来，但又能不对自己的寄主产生危害的菌，它们这些物质被人们称为真菌[13]。
内生真菌与宿主的关系
内生真菌虽会对人们产生某些危害，但也不能忽视它带来的有利影响，在了解分析中得知其化学特性后，发现它和寄主具有或多或少的相似性，因此，要努力增加其中的产量，能有效促进经济发展，对提高药用成分含量以及节源方面也有重大效用[14]。所以以凹叶厚朴为培养材料培养其内生真菌，提高其产量。既可以保护环境还可以挽救一种濒临灭绝的珍贵物种，对今后的研究有重要的意义。
内生真菌与寄主植株在生长过程中，形成了一种相互合作相互促进的关系。一方面，内生真菌次生代谢所产生的那些物质对草本植株或者我们赖以生存的生活环境有着有利作用，其保护特性得以展现；另外，植物可提供充足的空间和非常适宜生存的生长区域给内生真菌。内生真菌这类物质和它们得以生存的寄主之间，它们的生存方式具有较大的共通性，这种性质就注定了它们次级代谢物相似性的产生，由于生物化学成分及其杂乱难懂的特征，所以生存区域的差别也导致了它们相互依存关系的异变，这种变化程度会随着不同环境产生不同波动，它们之间正因为有着这种作用机制，所以要完全了解运用这技术还有着较大的阻碍。药用植物内生真菌它们产生的代谢物活性因子比较丰富，活跃度能与其生存的那些植物相提并论，它们的通性众所周知，在不久前，许多专家共同探索研究，其主题主要围绕两个话题，分别为：内共生理论和两种基因转移理论[15]。所以以凹叶厚朴为培养材料培养其内生真菌，提高其产量。既可以保护环境还可以挽救一种濒临灭绝的珍贵物种，对今后的研究有重要的意义。
内生真菌的产生
植物体中含有各种各样的内生真菌，此种观点可以在细菌感染宿主植物的过程中获得证明。由于长期经受恶劣气候环境的侵袭，植株体表生长在外界环境，植物表皮必然会有损伤处，外部微生物就会利用表皮的破损伤口进而入侵到植株内部，在植物的进化演变过程中，时间长了微生物就会适应植物体内部环境，并且利用植株内部环境的营养成分来促进自身的生长繁殖，经过植株本身一起抵抗外部恶劣的环境和长时间的演变，比如水涝、高温、干旱等自然现象。在恶劣不易生存的的糟糕状况共同对不利因素发出抵抗，植物内生菌渐渐生长成熟，围绕寄主展开对抗的过程中，它们之间关系也越发密切，而内生菌本身也会代谢一些功能和寄主植物相似的物质，因此理论上来说植物的种植年龄越长，内生菌含量应该越多。另外一些内生菌还会寄存在宿主的果实内，因其繁殖能力强且迅速，可强悍的存活于该植物体内，并具有遗传性。研究证明，很多生存在中草药体内的内生菌能产生携带药用价值的大量代谢物，这些代谢产物种类丰富，会产生大量化合物，例如
1 文献综述
1.1 植物简介 1
1.2 凹叶厚朴中的成分 1
1.2.1 凹叶厚朴的主要成分 1
1.2.2 其他 2
1.3 内生真菌 2
1.4 内生真菌与宿主的关系 2
1.5 内生真菌的产生 3
1.6 中药与内生真菌的关系 3
1.7 小结 4
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 实验仪器 5
2.1.3 材料及试剂 5
2.1.4 培养基的配制 6
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
1.6 中药与内生真菌的关系 3
1.7 小结 4
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 实验仪器 5
2.1.3 材料及试剂 5
2.1.4 培养基的配制 6
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种复壮 6
2.2.2 固体发酵培养 6
2.2.3 液体发酵培养 7
2.2.4 发酵液的提取 7
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
2.3.2 色谱条件 7
2.3.3 实验方法 7
2.4 结果与分析 8
2.4.1 线性关系 8
2.4.2 实验结果分析 9
结论 12
参考文献 13
致谢 15
文献综述
植物简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)是我国的珍贵药用树种，为木兰科。年份高的凹叶厚朴树全身皆可入药，有非常高的药用价值。主要生长在陕西南部、甘肃东南部、河南东南部、湖北西部、四川中部、贵州东北部[1]。凹叶厚朴为厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)的一个亚种，两者不同之处在于凹叶厚朴的叶先端凹缺，其他形态特征均相同。厚朴与凹叶厚朴生长环境与习性均相同，所以二者总是交错生长。凹叶厚朴其性温，味苦、辛；主治：燥湿消痰，下气除满。用于湿滞伤中，脘痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳[2]。临床多用来治疗细菌感染，炎症和胃肠道疾病等[3]。厚朴还是中国药典2015年版一部中许多丸剂或者一些治疗肝疾病药物的一些复方制剂的原材料[1]。凹叶厚朴的主要成分厚朴酚与和厚朴酚。由于凹叶厚朴对生长条件的要求较高，本来可以供其生长的地方就不是很多，而生长在温热、湿润气候的厚朴品质最佳。树木生长迟缓，而药用最多的树皮又恢复缓慢。由于凹叶厚朴在中药制剂中起到的作用越来越高，需求越来越大，目前可利用的野生资源较少，因此先后被列为国家二级保护中药材和国家二级保护植物[4]。种植的由于生长的地理位置不是最佳的生长环境所以质量得不到保障，故其资源日渐减少，供需矛盾日益突出。寻找新的途径和研究方法迫在眉睫。
凹叶厚朴中的成分
凹叶厚朴的主要成分
厚朴酚(Magnolol,MN)与和厚朴酚(Honokiol,HN)为二聚苯丙素类化合物，生活在十九世纪时代的学者藤田等先后逐渐从收集采购的植物厚朴中提取精分出了大量异构体成分，并从中论证了其原理与关系[5]。越来越多的人针对厚朴酚进行试验探讨，发现了其具有的很多功效，它不仅能够抑制氧化，还能为人类心理健康作出贡献，对社会人类身体带来的危险疾病也可发挥功用，其含有的活性程度很高[68]。虽然在某些领域的确表现出良好的临床疗效，但是若要推广或者要得到国内外学者们更高程度的认可，还需要对其单体做更深层次的基础及临床试验[9]。和厚朴酚具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[10]。
其他
厚朴除含有的有效成分除了挥发油、生物碱等成分外，还含有多种利用价值高的物质，它们占有的比例大约有百分之五左右，具有较强烈的活性[11]，除此之外，还含有许多羟基类物质或者大量不同形态和性质的酚类成分，可能还存在其他结构[12]。
内生真菌
植物内生真菌(Plant endophytic fungi)是指那些在特定环境状态下能在某一时期生存下来的或者终其一生都能在拥有强烈生机的宿主体内存活下来，但又能不对自己的寄主产生危害的菌，它们这些物质被人们称为真菌[13]。
内生真菌与宿主的关系
内生真菌虽会对人们产生某些危害，但也不能忽视它带来的有利影响，在了解分析中得知其化学特性后，发现它和寄主具有或多或少的相似性，因此，要努力增加其中的产量，能有效促进经济发展，对提高药用成分含量以及节源方面也有重大效用[14]。所以以凹叶厚朴为培养材料培养其内生真菌，提高其产量。既可以保护环境还可以挽救一种濒临灭绝的珍贵物种，对今后的研究有重要的意义。
内生真菌与寄主植株在生长过程中，形成了一种相互合作相互促进的关系。一方面，内生真菌次生代谢所产生的那些物质对草本植株或者我们赖以生存的生活环境有着有利作用，其保护特性得以展现；另外，植物可提供充足的空间和非常适宜生存的生长区域给内生真菌。内生真菌这类物质和它们得以生存的寄主之间，它们的生存方式具有较大的共通性，这种性质就注定了它们次级代谢物相似性的产生，由于生物化学成分及其杂乱难懂的特征，所以生存区域的差别也导致了它们相互依存关系的异变，这种变化程度会随着不同环境产生不同波动，它们之间正因为有着这种作用机制，所以要完全了解运用这技术还有着较大的阻碍。药用植物内生真菌它们产生的代谢物活性因子比较丰富，活跃度能与其生存的那些植物相提并论，它们的通性众所周知，在不久前，许多专家共同探索研究，其主题主要围绕两个话题，分别为：内共生理论和两种基因转移理论[15]。所以以凹叶厚朴为培养材料培养其内生真菌，提高其产量。既可以保护环境还可以挽救一种濒临灭绝的珍贵物种，对今后的研究有重要的意义。
内生真菌的产生
植物体中含有各种各样的内生真菌，此种观点可以在细菌感染宿主植物的过程中获得证明。由于长期经受恶劣气候环境的侵袭，植株体表生长在外界环境，植物表皮必然会有损伤处，外部微生物就会利用表皮的破损伤口进而入侵到植株内部，在植物的进化演变过程中，时间长了微生物就会适应植物体内部环境，并且利用植株内部环境的营养成分来促进自身的生长繁殖，经过植株本身一起抵抗外部恶劣的环境和长时间的演变，比如水涝、高温、干旱等自然现象。在恶劣不易生存的的糟糕状况共同对不利因素发出抵抗，植物内生菌渐渐生长成熟，围绕寄主展开对抗的过程中，它们之间关系也越发密切，而内生菌本身也会代谢一些功能和寄主植物相似的物质，因此理论上来说植物的种植年龄越长，内生菌含量应该越多。另外一些内生菌还会寄存在宿主的果实内，因其繁殖能力强且迅速，可强悍的存活于该植物体内，并具有遗传性。研究证明，很多生存在中草药体内的内生菌能产生携带药用价值的大量代谢物，这些代谢产物种类丰富，会产生大量化合物，例如
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