川明参活性物质分离及分析
目录
1 引言 1
1.1 川明参简介 1
1.2 研究现状 1
1.3 研究目的意义 3
2 材料和方法 4
2.1 仪器 4
2.2试剂 4
2.3 材料 4
2.4 方法 5
2.4.1紫外分光光度法最大波长的选择 5
2.4.2 紫外分光光度法精密度试验 5
2.4.3 紫外分光光度法稳定性试验 5
2.5 香豆素类物质的提取分离 5
2.5.1 单因素试验 5
2.5.2正交试验 6
2.6 定性定量分析 9
2.6.1 样品制备 9
2.6.2 红外光谱的定性分析 9
2.6.3 总香豆素定量分析 9
3 结果与分析 10
3.1 紫外分光光度法波长的选择 10
3.2 紫外分光光度法精密度试验 11
3.3 紫外分光光度法稳定性试验 11
3.3单因素试验结果 12
3.3.1 浸泡温度对香豆素得率的影响 12
3.3.2 浸泡时间对香豆素得率的影响 12
3.3.3 乙醇浓度对香豆素得率的影响 13
3.3.4 液料比对香豆素得率的影响 13
3.3.5 提取时间对香豆素得率的影响 14
3.4 正交试验 14
3.4.1 正交表及试验结果 14
3.4.2 方差分析 16
3.4.4 最优方案稳定性检验 17
3.4.5 最优方案的重复性检验 17
3.4.6 最优方案的精密 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
度检验 17
3.5 香豆素类物质的红外分析 18
3.5.1 红外光谱解析 18
3.5.2 香豆素的定量分析 20
结论 24
致谢 25
参考文献 26
1 引言
1.1 川明参简介
川明参（Radix Chuanmingshinis Violacei）又名明参、明沙参、土明参、沙参。伞形科植物，为我国特有单种属植物，是四川的道地药材[1]。川明参归肺、胃、肝经，具有润肺化痰、养阴清肺、健脾肋运、和胃、生津、解毒等功效，主治热病伤阴、肺燥咳嗽、脾虚少食、病后体弱，为“滋阴要药”适用于病后补虚和强壮身体，可入药亦可食用，是一药食两用的植物。主要分布于四川、湖北等地，主要分布在起于川西平原东部(金堂，清白江)，沿四川中部，东部(简阳，平武，巴中，南川)至湖北西部(宜昌，当阳)这一狭长地带，以四川苍溪县龙山镇最为集中，目前，龙山镇栽种川明参达1万多亩，占龙山总面积的1/3，为国内最大的川明参种植示范区，产量为350kg每亩，总产量为6000吨左右，产值为6000万元。除龙山外，四川巴中，金堂也也有一定面积的栽种。
1.2 研究现状
关于川明参的研究起步较晚，直至1996年饶高雄、王兴文等人才发表第一篇报道川明参化学成分的文章，为川明参的研究拉开了帷幕。在此期间他们在采自成都市清白江川明参的乙醇提取液中得到6.7%的醇提取物，在其残渣的水提取液中用醇沉的方式得到大量的沉淀（35%），后经检测证明了所得物中主要是香豆素和多糖类化合物，并首次在醇提取物中分离鉴定出川明参根部的7种化学成分，分别为香豆素伞形花内酯( umberlliferone )、 石防风素(deltoin)、 印度枸橘素( marmesin )、 异紫花前胡甙(ammijin ) 、非香豆素化合物， 新丁香色原酮(noreugenin) 、阿魏酸(ferulic acid)、胡罗卜甙(daucosterol)[2]。随后周燕、彭树林等人又在1999年发表了《川明参根部的化学成分》一文，报道了他们从产自金堂的川明参中所提取的8种化合物，分别为5 ， 8-二甲氧基补骨脂素、5-异戊烯基-8-甲氧基补骨脂素、procyanidin A-2、棚皮素-3-O-葡萄糖醛酸甙、芦丁、豆甾醇、豆甾醇-葡萄糖甙、棕榈酸和硬脂酸的混合物[3]。随着对川明参的进一步研究，人们将研究范围进一步扩大到对川明参茎叶的研究上来，如王明安、彭树林等人在2002年发表的《川明参茎叶中的化学成分》一文中介绍到他们从废弃的川明参茎叶的水煮液中分离得到8种化合物，并通过波谱分析鉴定了其中7种化合物，分别为是4-羟甲基-5-甲氧羰基乙基-6-甲氧基-苯并呋喃-7-O-U-D-葡萄糖甙、3-甲基-6-甲氧基-8-羟基-二氢异香豆素、异虎耳草素、白当归脑、氧化前胡素水合物、芸香瑞亭和芦丁。并发现4-羟甲基-5-甲氧羰基乙基-6-甲氧基-苯并呋喃-7-O-U-D-葡萄糖甙的甙元具有天然界罕见的4，5，6，7-四取代苯并呋喃结构骨架，故将该新化合物命名为川明参甙（chuanminshenoside）[4]。为川明参的研究开辟了一个新的领域，带来了新的思考，因此又有了李帮经、彭树林等人对川明参须根中化学成分的研究。川明参须根价格便宜，在市场上也作为滋补品出售，他们从川明参须根的乙醇提取物中分离鉴定出了10种化合物，其主要成分为线性呋喃香豆素类化合物，另外还有黄铜、甾体和三萜酸。主要有别欧前胡素、5-甲氧基-8-羟基补骨脂素、珊瑚菜内酯、欧前胡素、氧化前胡素水合物、3-甲基-6-甲氧基-8-羟基二氢异香豆素、豆甾醇、槲皮素、胡萝卜苷、齐墩果酸和乌苏酸混晶[5]。川明参的药理作用有报道[6]其多糖有抗诱变效应。此外，川明参磷脂含量丰富，提示其具有提高机体免疫功能，健脑益智，保肝降脂，增加胰岛素、骨细胞和神经细胞功能，延缓衰老等方面的作用[7]。在苏筱琳硕士学位论文《川明参药效活性部位化学成分及药材质量标准研究》中，苏筱琳通过化学分离和药效学筛选比较，确定出其石油醚部位为川明参镇咳祛痰以及免疫药效活性部位，并通过反复硅胶柱层析从该部位中分离出8个化合物，依次为：2，6一二甲氧基苯甲酸、丁二酸、豆甾醇、大黄酚、香草酸、豆甾醇葡萄糖苷、棕榈酸、8-羟基-5-甲氧基补骨质素，其中前四种化合物为首次分离得到。另外，作者对川明参的质量标准进行了初步的探索，建立了以分光光度法为检测手段的总香豆素含量测定方法。为最终揭示川明参药效物质基础，完善其质量控制方法，进一步扩大川明参临床应用范围和新药研发奠定了一定的科学基础[8]。是川明参研究过程中突破性的一步。随后谌立巍、刘静、赵波等对紫外分光光度法测定川明参中的香豆素类成分含量的方法做了进一步的优化和验证，使得该方法更为简便可靠，在川明参药材质量控制中起着重要作用[9]。随着香豆素含量测定方法的建立，对川明参中香豆素的研究进入了更加细致的阶段，赵波、李宏、刘军等以该成分为考察指标的提取方法被确定下来，其最佳条件为：30倍量甲醇回流提取川明参药材2次，每次1小时。并在产自四川金堂的川明参中首次分离得到补骨脂内酯[10]。川明参的化学成分复杂，出多糖以外其他活性成分含量较低，采用某单一成分作为定量指标有一定的难度，因此出现了用反相高效液相色谱法建立的标准图谱。此方法更为稳定可靠、能确切反应和综合评价川明参药材及其加工品的质量[11]。如今安全用药的观念深入人心，宋芳芳在其学位论文中通过动物实验对川明参的安全性做了初步的研究。并采用TLC和HPLC对茎叶与根各个提取部位和茎叶中总黄酮含量的测定方法[12]。为川明参临床用药的安全性及川明参的综合利用奠定了一定基础。随着科研工作者对川明参的深入研究，董红敏、李路等人运用超声波辅助提取技术对川明参中的挥发油进行了提取，并用GC-MS对其化学成分进行了分析。确定出了川明参中挥发油提取的的最佳工艺条件，即液料比8:1(mL/g)、超声功率175W、超声时间28min。在此工艺条件下得率为2.213%±0.042%。在川明参挥发油中共检测出76种成分，鉴定并确定出其中42种化合物，被鉴定物质相对含量占挥发油总量的97.37%。本方法可为川明参的进一步开发和利用提供参考[13]。作为一种传统的药食两用的植物，针对其营养价值的研究近年来也开始发展起来，如颜静、刘继、熊亚波等人就对产自阆中的川明参的各个部位的主要营养成分及氨基酸组成进行了分析。研究结果表明，川明参根茎叶营养成分差异较大，其中川明参叶的VC(4.73mg/100g)、蛋白质（3.97g/100g）、钙(43.64mg/kg)和铁(7.47mg/kg)营养素显著高于根、茎含量，且叶中总氨基酸、人体必需氨基酸、鲜味氨基酸的含量均高于根和茎中的含量。另外，川明参叶中各种人体必需氨基酸种类齐全，且比例均衡，与WHO/FAO 提出的推荐值较为接近[14]。上述的研究从川明参中分离出了大量的天然化合物，得出了川明参的石油醚部位主要含有各种香豆素类化合物这一结论。目前提取方法飞速发展，出现了大量新兴技术，如超临界流体CO2、亚临界水和离子液体技术、超声波辅助提取等[15]。随着这些技术的发展，天然产物活性物质的提取定将取得长足进步。
1 引言 1
1.1 川明参简介 1
1.2 研究现状 1
1.3 研究目的意义 3
2 材料和方法 4
2.1 仪器 4
2.2试剂 4
2.3 材料 4
2.4 方法 5
2.4.1紫外分光光度法最大波长的选择 5
2.4.2 紫外分光光度法精密度试验 5
2.4.3 紫外分光光度法稳定性试验 5
2.5 香豆素类物质的提取分离 5
2.5.1 单因素试验 5
2.5.2正交试验 6
2.6 定性定量分析 9
2.6.1 样品制备 9
2.6.2 红外光谱的定性分析 9
2.6.3 总香豆素定量分析 9
3 结果与分析 10
3.1 紫外分光光度法波长的选择 10
3.2 紫外分光光度法精密度试验 11
3.3 紫外分光光度法稳定性试验 11
3.3单因素试验结果 12
3.3.1 浸泡温度对香豆素得率的影响 12
3.3.2 浸泡时间对香豆素得率的影响 12
3.3.3 乙醇浓度对香豆素得率的影响 13
3.3.4 液料比对香豆素得率的影响 13
3.3.5 提取时间对香豆素得率的影响 14
3.4 正交试验 14
3.4.1 正交表及试验结果 14
3.4.2 方差分析 16
3.4.4 最优方案稳定性检验 17
3.4.5 最优方案的重复性检验 17
3.4.6 最优方案的精密 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
度检验 17
3.5 香豆素类物质的红外分析 18
3.5.1 红外光谱解析 18
3.5.2 香豆素的定量分析 20
结论 24
致谢 25
参考文献 26
1 引言
1.1 川明参简介
川明参（Radix Chuanmingshinis Violacei）又名明参、明沙参、土明参、沙参。伞形科植物，为我国特有单种属植物，是四川的道地药材[1]。川明参归肺、胃、肝经，具有润肺化痰、养阴清肺、健脾肋运、和胃、生津、解毒等功效，主治热病伤阴、肺燥咳嗽、脾虚少食、病后体弱，为“滋阴要药”适用于病后补虚和强壮身体，可入药亦可食用，是一药食两用的植物。主要分布于四川、湖北等地，主要分布在起于川西平原东部(金堂，清白江)，沿四川中部，东部(简阳，平武，巴中，南川)至湖北西部(宜昌，当阳)这一狭长地带，以四川苍溪县龙山镇最为集中，目前，龙山镇栽种川明参达1万多亩，占龙山总面积的1/3，为国内最大的川明参种植示范区，产量为350kg每亩，总产量为6000吨左右，产值为6000万元。除龙山外，四川巴中，金堂也也有一定面积的栽种。
1.2 研究现状
关于川明参的研究起步较晚，直至1996年饶高雄、王兴文等人才发表第一篇报道川明参化学成分的文章，为川明参的研究拉开了帷幕。在此期间他们在采自成都市清白江川明参的乙醇提取液中得到6.7%的醇提取物，在其残渣的水提取液中用醇沉的方式得到大量的沉淀（35%），后经检测证明了所得物中主要是香豆素和多糖类化合物，并首次在醇提取物中分离鉴定出川明参根部的7种化学成分，分别为香豆素伞形花内酯( umberlliferone )、 石防风素(deltoin)、 印度枸橘素( marmesin )、 异紫花前胡甙(ammijin ) 、非香豆素化合物， 新丁香色原酮(noreugenin) 、阿魏酸(ferulic acid)、胡罗卜甙(daucosterol)[2]。随后周燕、彭树林等人又在1999年发表了《川明参根部的化学成分》一文，报道了他们从产自金堂的川明参中所提取的8种化合物，分别为5 ， 8-二甲氧基补骨脂素、5-异戊烯基-8-甲氧基补骨脂素、procyanidin A-2、棚皮素-3-O-葡萄糖醛酸甙、芦丁、豆甾醇、豆甾醇-葡萄糖甙、棕榈酸和硬脂酸的混合物[3]。随着对川明参的进一步研究，人们将研究范围进一步扩大到对川明参茎叶的研究上来，如王明安、彭树林等人在2002年发表的《川明参茎叶中的化学成分》一文中介绍到他们从废弃的川明参茎叶的水煮液中分离得到8种化合物，并通过波谱分析鉴定了其中7种化合物，分别为是4-羟甲基-5-甲氧羰基乙基-6-甲氧基-苯并呋喃-7-O-U-D-葡萄糖甙、3-甲基-6-甲氧基-8-羟基-二氢异香豆素、异虎耳草素、白当归脑、氧化前胡素水合物、芸香瑞亭和芦丁。并发现4-羟甲基-5-甲氧羰基乙基-6-甲氧基-苯并呋喃-7-O-U-D-葡萄糖甙的甙元具有天然界罕见的4，5，6，7-四取代苯并呋喃结构骨架，故将该新化合物命名为川明参甙（chuanminshenoside）[4]。为川明参的研究开辟了一个新的领域，带来了新的思考，因此又有了李帮经、彭树林等人对川明参须根中化学成分的研究。川明参须根价格便宜，在市场上也作为滋补品出售，他们从川明参须根的乙醇提取物中分离鉴定出了10种化合物，其主要成分为线性呋喃香豆素类化合物，另外还有黄铜、甾体和三萜酸。主要有别欧前胡素、5-甲氧基-8-羟基补骨脂素、珊瑚菜内酯、欧前胡素、氧化前胡素水合物、3-甲基-6-甲氧基-8-羟基二氢异香豆素、豆甾醇、槲皮素、胡萝卜苷、齐墩果酸和乌苏酸混晶[5]。川明参的药理作用有报道[6]其多糖有抗诱变效应。此外，川明参磷脂含量丰富，提示其具有提高机体免疫功能，健脑益智，保肝降脂，增加胰岛素、骨细胞和神经细胞功能，延缓衰老等方面的作用[7]。在苏筱琳硕士学位论文《川明参药效活性部位化学成分及药材质量标准研究》中，苏筱琳通过化学分离和药效学筛选比较，确定出其石油醚部位为川明参镇咳祛痰以及免疫药效活性部位，并通过反复硅胶柱层析从该部位中分离出8个化合物，依次为：2，6一二甲氧基苯甲酸、丁二酸、豆甾醇、大黄酚、香草酸、豆甾醇葡萄糖苷、棕榈酸、8-羟基-5-甲氧基补骨质素，其中前四种化合物为首次分离得到。另外，作者对川明参的质量标准进行了初步的探索，建立了以分光光度法为检测手段的总香豆素含量测定方法。为最终揭示川明参药效物质基础，完善其质量控制方法，进一步扩大川明参临床应用范围和新药研发奠定了一定的科学基础[8]。是川明参研究过程中突破性的一步。随后谌立巍、刘静、赵波等对紫外分光光度法测定川明参中的香豆素类成分含量的方法做了进一步的优化和验证，使得该方法更为简便可靠，在川明参药材质量控制中起着重要作用[9]。随着香豆素含量测定方法的建立，对川明参中香豆素的研究进入了更加细致的阶段，赵波、李宏、刘军等以该成分为考察指标的提取方法被确定下来，其最佳条件为：30倍量甲醇回流提取川明参药材2次，每次1小时。并在产自四川金堂的川明参中首次分离得到补骨脂内酯[10]。川明参的化学成分复杂，出多糖以外其他活性成分含量较低，采用某单一成分作为定量指标有一定的难度，因此出现了用反相高效液相色谱法建立的标准图谱。此方法更为稳定可靠、能确切反应和综合评价川明参药材及其加工品的质量[11]。如今安全用药的观念深入人心，宋芳芳在其学位论文中通过动物实验对川明参的安全性做了初步的研究。并采用TLC和HPLC对茎叶与根各个提取部位和茎叶中总黄酮含量的测定方法[12]。为川明参临床用药的安全性及川明参的综合利用奠定了一定基础。随着科研工作者对川明参的深入研究，董红敏、李路等人运用超声波辅助提取技术对川明参中的挥发油进行了提取，并用GC-MS对其化学成分进行了分析。确定出了川明参中挥发油提取的的最佳工艺条件，即液料比8:1(mL/g)、超声功率175W、超声时间28min。在此工艺条件下得率为2.213%±0.042%。在川明参挥发油中共检测出76种成分，鉴定并确定出其中42种化合物，被鉴定物质相对含量占挥发油总量的97.37%。本方法可为川明参的进一步开发和利用提供参考[13]。作为一种传统的药食两用的植物，针对其营养价值的研究近年来也开始发展起来，如颜静、刘继、熊亚波等人就对产自阆中的川明参的各个部位的主要营养成分及氨基酸组成进行了分析。研究结果表明，川明参根茎叶营养成分差异较大，其中川明参叶的VC(4.73mg/100g)、蛋白质（3.97g/100g）、钙(43.64mg/kg)和铁(7.47mg/kg)营养素显著高于根、茎含量，且叶中总氨基酸、人体必需氨基酸、鲜味氨基酸的含量均高于根和茎中的含量。另外，川明参叶中各种人体必需氨基酸种类齐全，且比例均衡，与WHO/FAO 提出的推荐值较为接近[14]。上述的研究从川明参中分离出了大量的天然化合物，得出了川明参的石油醚部位主要含有各种香豆素类化合物这一结论。目前提取方法飞速发展，出现了大量新兴技术，如超临界流体CO2、亚临界水和离子液体技术、超声波辅助提取等[15]。随着这些技术的发展，天然产物活性物质的提取定将取得长足进步。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zygc/1495.html
