ems诱导水稻pospt6gus转基因材料的突变体的筛选和鉴定
摘要：利用EMS对纯合单拷贝稳定遗传的转基因水稻材料pOsPT6::GUS进行化学诱变，以构建基因突变群体。实验前期对M0突变群体进行单株鉴定，已经初步筛选出疑似突变体植株，单本移栽并单株收获。而本课题主要是对已经获得的M1代疑似突变体材料进行遗传性状统计以及相关生理指标的测定和分子水平的鉴定，以确定该突变体材料是否可靠。结果显示，对M1代突变群体进行GUS染色，结果显示约3:1的分离比。在正常供磷和低磷条件下，突变体材料及突变体分离材料与野生型之间不论是生物量还是可提取磷含量均没有显著差异，但是与pOsPT6::GUS纯合体材料相比，生物量显著提高，但可提取磷含量没有显著差异。定量结果显示，内源OsPT6基因的表达在各个不同材料中均符合受缺磷上调的特点，而GUS基因的表达与GUS染色结果一致，突变体材料中GUS基因表达在正常磷处理条件下极显著高于纯合体和分离群体材料中GUS基因的表达。综合上述实验结果，所获得突变体材料为单基因的显性突变，且突变位置可能发生在GUS基因前的OsPT6启动子区域，推测可能是某个顺式作用元件发生突变，导致其不受磷调控，为下一步实验奠定研究基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Keywords 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1 材料与试剂 3
1.1.1 植株材料 3
1.1.2 试剂配制 3
1.1.2.1 水稻种子发苗以及阳性苗鉴定试剂 3
1.1.2.2 水稻植株可提取磷试剂 3
1.1.2.3 水稻总RNA的提取试剂 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 M1代诱变水稻材料准备 3
1.2.2 水稻遗传性状统计 3
1.2.3 水稻可提取磷的提取 3
1.2.4 水稻总RNA的提取及QPCR 3
2 结果分析 3
2.1 水稻遗传性状统计结果分析 4
2.2 生理数据结果分析 5
2.3 水稻总RNA浓度测定 6
2.4 QPCR结果分析 7
3 讨论 8
3.1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
EMS诱变筛选突变植株 8
3.2 QPCR分析 8
3.3 顺式作用元件与转录因子 9
致谢 9
参考文献 10
附录一 水稻完全营养液配方 12
附录二 GUS染液配方及FAA固定液配方 12
附录三 植物有效磷含量的测定 13
附录四 水稻总RNA的提取 14
附录五 cDNA的合成 14
附录六 RealTime定量PCR 15
EMS诱导水稻pOsPT6::GUS转基因材料的突变体
的筛选和鉴定
引言
引言
磷（Phosphorus）作为植物生长发育所需的必须大量元素之一，其在植物生命过程中发挥着重要的作用。磷不但是植物核酸、细胞膜系统、ATP等重要的组成成分，同时还参与植物生命过程中的信号转导[1]，以及提高植物的抗寒冷胁迫能力。
鉴于磷对植物的重要意义，国内外学者对磷素的相关基因以及转录因子进行了大量的研究，在标定目的基因的表达调控时常常用到报告基因，目前常用的有GUS、荧光蛋白等。报告基因是一种编码易于检测的蛋白质的基因，其与目的基因的启动子相结合后可以在细胞或亚细胞水平上判定目的基因的表达模式[24]。
艾鹏慧等[5]在2009年通过启动子融合GUS报告基因方法，验证了水稻OsPT6是一个受缺磷特异性诱导的基因，并且其在缺磷条件下，表达丰度很高，这在其后续实验中也进行了验证。孙清华等[6]同样采用GUS报告基因的方式验证TsVP1和AVP1两个基因的组织表达模式。
目前，植物缺磷信号转导途径的研究取得了诸多重大进展，各种类型的基因相继被报道在该途径中发挥着重要作用。其中，转录因子基因在分子调控网络中更是起着关键的调控作用。
2001年，Rubio等报道了拟南芥缺磷信号转导途径的中心调控因子AtPHR1[7]。他们通过将拟南芥中受缺磷诱导（PSI: Phosphate StarvationInduced）强烈表达的基因AtIPS1的启动子融合GUS报告基因的转基因拟南芥植株进行EMS诱变，将诱变后的25000个群体在缺磷处理9天后进行GUS活体染色，将其中GUS染色为阴性的，挑选出来作为AtIPS1上游转录因子突变的候选植株，通过图位克隆的方法将基因定位在了拟南芥4号染色体上的一段约120kb的区域内，最终定位到了AtPHR1。并通过分子生物学手段，证明AtPHR1与AtIPS1等受缺磷诱导的基因(PSI基因)的启动子区域中的一个顺式调控元件P1BS (长度为8个碱基对的非完美的回文序列：GNATATNC) 结合，从而调控其表达。AtPHR1是迄今为止在高等植物中最早发现也最为关键的转录因子。
随着反向遗传学的兴起，水稻、玉米等作物的全基因组测序的完成以及分子生物学技术的不断发展，水稻 (Oryza sativa) 、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula) 和四季豆 (Phaseolus vulgaris) 中AtPHR1的功能同源基因相继被克隆及功能鉴定[810]。
而通过EMS化学诱变转基因材料，筛选突变体，克隆到基因的实例还有拟南芥中的AtPHF1的发现。AtPHF1 (PHosphate Transporter Traffic Facilitator 1) 编码SEC12相关蛋白，受缺磷诱导表达。发现其所用的思路与AtPHR1恰恰相反，即筛选出在正常供磷条件下能够检测到强烈GUS活性的经EMS诱变的pAtIPS1::GUS植株[11]。phf1突变植株表现出对缺磷胁迫的超敏感及对五价砷酸盐较强的抗性 (五价砷酸盐可通过磷酸盐转运蛋白进入植物体内[12])。研究者进一步的研究发现，phf1突变体中高亲和磷酸盐转运蛋白AtPht1;1不能正确定位到细胞质膜上，而是停留在了内质网中，且AtPHF1本身定位在内质网。由此推测AtPHF1负责AtPht1;1蛋白trafficking过程中从内质网的脱离。此为首次报道植物中PT基因的trafficking过程也需要辅助蛋白 (accessory protein) 来完成。
近年来，在该研究领域，科学家们针对这些信号转导的分子机制做了大量的研究，初步构建了植物缺磷信号转导途径的分子调控网络。但主要集中在模式作物拟南芥身上，水稻缺磷信号转导途径的分子调控网络更为复杂，许多磷酸盐转运蛋白（Phosphate transporter, PT）的上游转录因子仍有待挖掘。
因此，针对水稻OsPT6基因启动子融合GUS报告基因的纯合单拷贝稳定遗传的转基因水稻材料，通过EMS化学诱变的方法，筛选符合条件的突变体并鉴定，以期能获得OsPT6基因上游的转录因子，对其进行克隆和功能验证，并完善水稻缺磷信号转导途径的分子调控网络，这对于以转基因为主导技术的遗传改良方法，培育磷高效利用的优质水稻品种具有重大的社会和经济意义。
1材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 植株材料
水稻材料为对pOsPT6::GUS纯合体材料进行EMS诱变后经筛选而得到的水稻种子，以及pOsPT6::GUS纯合体和野生型日本晴。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Keywords 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1 材料与试剂 3
1.1.1 植株材料 3
1.1.2 试剂配制 3
1.1.2.1 水稻种子发苗以及阳性苗鉴定试剂 3
1.1.2.2 水稻植株可提取磷试剂 3
1.1.2.3 水稻总RNA的提取试剂 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 M1代诱变水稻材料准备 3
1.2.2 水稻遗传性状统计 3
1.2.3 水稻可提取磷的提取 3
1.2.4 水稻总RNA的提取及QPCR 3
2 结果分析 3
2.1 水稻遗传性状统计结果分析 4
2.2 生理数据结果分析 5
2.3 水稻总RNA浓度测定 6
2.4 QPCR结果分析 7
3 讨论 8
3.1
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
EMS诱变筛选突变植株 8
3.2 QPCR分析 8
3.3 顺式作用元件与转录因子 9
致谢 9
参考文献 10
附录一 水稻完全营养液配方 12
附录二 GUS染液配方及FAA固定液配方 12
附录三 植物有效磷含量的测定 13
附录四 水稻总RNA的提取 14
附录五 cDNA的合成 14
附录六 RealTime定量PCR 15
EMS诱导水稻pOsPT6::GUS转基因材料的突变体
的筛选和鉴定
引言
引言
磷（Phosphorus）作为植物生长发育所需的必须大量元素之一，其在植物生命过程中发挥着重要的作用。磷不但是植物核酸、细胞膜系统、ATP等重要的组成成分，同时还参与植物生命过程中的信号转导[1]，以及提高植物的抗寒冷胁迫能力。
鉴于磷对植物的重要意义，国内外学者对磷素的相关基因以及转录因子进行了大量的研究，在标定目的基因的表达调控时常常用到报告基因，目前常用的有GUS、荧光蛋白等。报告基因是一种编码易于检测的蛋白质的基因，其与目的基因的启动子相结合后可以在细胞或亚细胞水平上判定目的基因的表达模式[24]。
艾鹏慧等[5]在2009年通过启动子融合GUS报告基因方法，验证了水稻OsPT6是一个受缺磷特异性诱导的基因，并且其在缺磷条件下，表达丰度很高，这在其后续实验中也进行了验证。孙清华等[6]同样采用GUS报告基因的方式验证TsVP1和AVP1两个基因的组织表达模式。
目前，植物缺磷信号转导途径的研究取得了诸多重大进展，各种类型的基因相继被报道在该途径中发挥着重要作用。其中，转录因子基因在分子调控网络中更是起着关键的调控作用。
2001年，Rubio等报道了拟南芥缺磷信号转导途径的中心调控因子AtPHR1[7]。他们通过将拟南芥中受缺磷诱导（PSI: Phosphate StarvationInduced）强烈表达的基因AtIPS1的启动子融合GUS报告基因的转基因拟南芥植株进行EMS诱变，将诱变后的25000个群体在缺磷处理9天后进行GUS活体染色，将其中GUS染色为阴性的，挑选出来作为AtIPS1上游转录因子突变的候选植株，通过图位克隆的方法将基因定位在了拟南芥4号染色体上的一段约120kb的区域内，最终定位到了AtPHR1。并通过分子生物学手段，证明AtPHR1与AtIPS1等受缺磷诱导的基因(PSI基因)的启动子区域中的一个顺式调控元件P1BS (长度为8个碱基对的非完美的回文序列：GNATATNC) 结合，从而调控其表达。AtPHR1是迄今为止在高等植物中最早发现也最为关键的转录因子。
随着反向遗传学的兴起，水稻、玉米等作物的全基因组测序的完成以及分子生物学技术的不断发展，水稻 (Oryza sativa) 、蒺藜苜蓿 (Medicago truncatula) 和四季豆 (Phaseolus vulgaris) 中AtPHR1的功能同源基因相继被克隆及功能鉴定[810]。
而通过EMS化学诱变转基因材料，筛选突变体，克隆到基因的实例还有拟南芥中的AtPHF1的发现。AtPHF1 (PHosphate Transporter Traffic Facilitator 1) 编码SEC12相关蛋白，受缺磷诱导表达。发现其所用的思路与AtPHR1恰恰相反，即筛选出在正常供磷条件下能够检测到强烈GUS活性的经EMS诱变的pAtIPS1::GUS植株[11]。phf1突变植株表现出对缺磷胁迫的超敏感及对五价砷酸盐较强的抗性 (五价砷酸盐可通过磷酸盐转运蛋白进入植物体内[12])。研究者进一步的研究发现，phf1突变体中高亲和磷酸盐转运蛋白AtPht1;1不能正确定位到细胞质膜上，而是停留在了内质网中，且AtPHF1本身定位在内质网。由此推测AtPHF1负责AtPht1;1蛋白trafficking过程中从内质网的脱离。此为首次报道植物中PT基因的trafficking过程也需要辅助蛋白 (accessory protein) 来完成。
近年来，在该研究领域，科学家们针对这些信号转导的分子机制做了大量的研究，初步构建了植物缺磷信号转导途径的分子调控网络。但主要集中在模式作物拟南芥身上，水稻缺磷信号转导途径的分子调控网络更为复杂，许多磷酸盐转运蛋白（Phosphate transporter, PT）的上游转录因子仍有待挖掘。
因此，针对水稻OsPT6基因启动子融合GUS报告基因的纯合单拷贝稳定遗传的转基因水稻材料，通过EMS化学诱变的方法，筛选符合条件的突变体并鉴定，以期能获得OsPT6基因上游的转录因子，对其进行克隆和功能验证，并完善水稻缺磷信号转导途径的分子调控网络，这对于以转基因为主导技术的遗传改良方法，培育磷高效利用的优质水稻品种具有重大的社会和经济意义。
1材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 植株材料
水稻材料为对pOsPT6::GUS纯合体材料进行EMS诱变后经筛选而得到的水稻种子，以及pOsPT6::GUS纯合体和野生型日本晴。
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