均苯四甲酸降解菌的筛选与降解特性的研究
摘 要：均苯四甲酸是一种重要的化工材料，在化工合成行业及高分子材料行业中具有重要的作用。高浓度的均苯四甲酸废水具有COD值高、酸性强、可生化性差等特点，处理困难，给自然环境和人体健康造成巨大危害。本研究从均苯四甲酸生产厂污水站生化池的活性污泥中分离到了一株能够高效降解均苯四甲酸的菌株将其命名为DP-1，该菌株能以均苯四甲酸为唯一碳源和能源进行生长。根据16S rRNA序列同源性分析，并结合菌株的表型特征和生理生化特性，将菌株DP-1初步鉴定为Arthrobacter phenanthrenivorans。从温度、pH、NaCl浓度对菌株的生长特性进行研究。从温度、pH、均苯四甲酸初始浓度、接菌量对菌株降解均苯四甲酸的性能进行研究。实验结果表明：该菌株的最适生长温度为30℃，生长最适pH=7，生长最适NaCl浓度为10g/L；最适降解条件为： 30℃， pH=7，均苯四甲酸初始浓度为200mg/L，接菌量为2%。
目录
摘 要 3
ABSTRACT 4
第一章 绪论 5
第二章 均苯四甲酸降解菌的分离与鉴定 2
2.1 材料与方法 7
2.1.1 实验药品及配方 7
2.1.2 均苯四甲酸含量检测方法 7
2.1.3 降解菌株的富集、分离与纯化 7
2.1.4 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定 8
2.1.5 降解菌株的16S rRNA基因序列分析 8
2.1.6 降解菌株系统发育定位 10
2.2 结果与讨论 10
2.2.1 降解菌株的分离筛选 10
2.2.2 菌株DP1的菌落形态及生理生化特征 11
2.2.3 菌株DP1的系统发育定位 12
第三章 均苯四甲酸降解菌的生长、降解特性研究 14
3.1 材料与方法 14
3.1.1 供试菌株 14
3.1.2 培养基与供试药品 14
3.1.3 菌种制备以及菌体生长量的测定 14
3.1.4 菌株DP1在LB液体培养基中的生长曲线 14
3.1.5 环境因素对菌株DP1生长的影响 15
r /> 3.1.6 菌株DP1在无机盐培养基中的生长降解曲线 15
3.1.7 环境因素对菌株DP1降解率的影响 16
3.2 结果与讨论 17
3.2.1 菌株DP1在LB培养基中的生长曲线 17
3.2.2 环境因素对菌株DP1生长的影响 17
3.2.3 菌株DP1在无机盐培养基中的生长降解曲线 20
3.2.4 环境因素对菌株DP1降解率的影响 21
第四章 总结 25
致谢 26
参考文献 27
研究中获得的相关DNA序列 28
均苯四甲酸降解菌的筛选与降解特性的研究
引言
第一章 绪论
均苯四甲酸，别名为1,2,4,5苯四甲酸，英文名称为12,4,5Benzenetetracarboxylicacid，一般简称为均酸，英文缩写为PMA。它的分子式为C10H6O8，相对分子质量为254.12，其结构式见图1。在不同纯度下会呈现出白色至微黄色的粉末状结晶，。均苯四甲酸的无水物熔点为276℃，其水合物以2结晶水居多。均苯四甲酸水合物的熔点为242℃，相对密度1.79，易溶于醇类，难溶于乙醚和水，能升华。均苯四甲酸对人体具有一定的毒性，会刺激人的皮肤和粘膜[1]。均苯四甲酸是一种重要中间体，可以通过均苯四甲酸二酐水解制得，在工业生产中是十分重要的化合物。它主要用于合成聚酰亚胺、均苯四酸辛酯等，是生产消光固化剂的主要原料[2]。
图1均苯四甲酸的结构式
Fig.1 The structure of Pyromellitic acid
均苯四甲酸是一种十分重要的化工原料，其脱水产生的均苯四甲酸二酐[3]，简称均酐，它因具有特殊的结构而被广泛应用。它能做成许多具有优越的耐热性、电绝缘性和耐化学药品性的产品[4]。均苯四甲酸主要来源于均苯四甲酸和均苯四甲酸二酐的生产和提纯过程，在均苯四甲酸二酐的提纯过程中会产生高浓度的芳香酸废水，其主要成分中就包含均苯四甲酸[5]。
可以采用在常压下的气相中通过1,2,4,5四烷基苯的选择性氧化来制备均苯四甲酸二酐。将含有1,2,4,5四烷基苯的气态进料流以4,00012,000 hr?1的空间速度通过空气，以空气中的分子氧作为氧化剂发生选择性氧化，并在300450℃的温度下脱水产生均苯四甲酸二酐[6]。
均苯四甲酸二酐结构式特殊，它含有四个对称的羧基，这样特殊的结构让它能够具有很多其他苯羧酸所没有的特殊性能。其主要用途如下：
1、耐热聚合物。聚酰亚胺的原料中最必不可少的原料之一就是均酐。
2、增塑剂。聚氯乙烯耐热增塑剂的原料之一就有均苯四甲酸二酐，它还常被用于生产医用、食用方面的聚氯乙烯制品。
3、环氧树脂固化剂。大型的绝缘性固件需要靠均酐来做固化剂，均酐还具有快速粘接的性能，因此可以制作成耐冲击性瞬时胶粘剂。
4、均酐和高碳醇进行分步酯化反应可制得具有生物降解性能的“绿色”表面活化剂或乳化剂。还可以用作水处理剂、金属缓蚀剂、皮革鞣剂的添加剂、柴油的低温性能改进剂、电子摄影色调改善剂以及制耐高温润滑剂等[4]。
5、生产消光剂。均酐（四酸）和环丙醚反应制造的消光剂效果好、强度高、不易泛黄，主要用于粉末涂料[7]。
微生物降解被认为是降低均苯四甲酸对环境的影响的最好途径，也是最重要的途径之一，不同微生物对不同染污物能通过氧化、水解、脱羧等不同方式对其进行降解。目前能够收集到的关于利微生物降解均苯四甲酸的资料非常有限，说明大家对均苯四甲酸降解菌研究不多。
近年来随着我国经济的持续上升与发展，均苯四甲酸和均苯四甲酸二酐作为重要的化工原料其生产量与使用量也日渐增长。伴随二者生产量和使用量一起增长的还有在它们的生产、使用过程中产生的均苯四甲酸高浓度废水。这些废水具有高COD值、pH值低、可生化性差等特点，这些也都是均苯四甲酸废水处理的重点和难点[8]。
为了弥补目前均苯四甲酸降解菌研究的匮乏，本实验将从活性污泥中分离一种能够高效降解均苯四甲酸的菌株，然后对其降解特性和生长特性进行研究。
第二章 均苯四甲酸降解菌的分离与鉴定
2.1 材料与方法
2.1.1 实验药品及配方
无机盐培养基（g.L1）：NaCl 1.0，(NH4)2SO4 1.0，K2HPO4.7H2O 1.96，KH2PO4 0.5，MgSO4.7H2O 0.2，去离子水补足至1000 ml，pH 7.0~7.2，固体培养基为加入琼脂20g/L（即2.0g/100ml）；在121℃下灭菌20min。
LB培养基（g.L1）：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，去离子水补足至1000 ml，pH 7.0~7.2；固体培养基为加入琼脂20g/L（即2.0g/100ml）；在121℃下灭菌20min。
富集培养基：将均苯四甲酸按需求浓度加入液体无机盐培养基中，固体培养基为加入琼脂20g/L（即2.0g/100ml）；在121℃下灭菌20min。
PBS缓冲液（g.L1）：NaCl 8.0，KCl 0.2，Na2HPO4 1.44，K2HPO4 0.24，去离子水补足至1000 ml，pH 7.5；在121℃下灭菌20min。
目录
摘 要 3
ABSTRACT 4
第一章 绪论 5
第二章 均苯四甲酸降解菌的分离与鉴定 2
2.1 材料与方法 7
2.1.1 实验药品及配方 7
2.1.2 均苯四甲酸含量检测方法 7
2.1.3 降解菌株的富集、分离与纯化 7
2.1.4 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定 8
2.1.5 降解菌株的16S rRNA基因序列分析 8
2.1.6 降解菌株系统发育定位 10
2.2 结果与讨论 10
2.2.1 降解菌株的分离筛选 10
2.2.2 菌株DP1的菌落形态及生理生化特征 11
2.2.3 菌株DP1的系统发育定位 12
第三章 均苯四甲酸降解菌的生长、降解特性研究 14
3.1 材料与方法 14
3.1.1 供试菌株 14
3.1.2 培养基与供试药品 14
3.1.3 菌种制备以及菌体生长量的测定 14
3.1.4 菌株DP1在LB液体培养基中的生长曲线 14
3.1.5 环境因素对菌株DP1生长的影响 15
r /> 3.1.6 菌株DP1在无机盐培养基中的生长降解曲线 15
3.1.7 环境因素对菌株DP1降解率的影响 16
3.2 结果与讨论 17
3.2.1 菌株DP1在LB培养基中的生长曲线 17
3.2.2 环境因素对菌株DP1生长的影响 17
3.2.3 菌株DP1在无机盐培养基中的生长降解曲线 20
3.2.4 环境因素对菌株DP1降解率的影响 21
第四章 总结 25
致谢 26
参考文献 27
研究中获得的相关DNA序列 28
均苯四甲酸降解菌的筛选与降解特性的研究
引言
第一章 绪论
均苯四甲酸，别名为1,2,4,5苯四甲酸，英文名称为12,4,5Benzenetetracarboxylicacid，一般简称为均酸，英文缩写为PMA。它的分子式为C10H6O8，相对分子质量为254.12，其结构式见图1。在不同纯度下会呈现出白色至微黄色的粉末状结晶，。均苯四甲酸的无水物熔点为276℃，其水合物以2结晶水居多。均苯四甲酸水合物的熔点为242℃，相对密度1.79，易溶于醇类，难溶于乙醚和水，能升华。均苯四甲酸对人体具有一定的毒性，会刺激人的皮肤和粘膜[1]。均苯四甲酸是一种重要中间体，可以通过均苯四甲酸二酐水解制得，在工业生产中是十分重要的化合物。它主要用于合成聚酰亚胺、均苯四酸辛酯等，是生产消光固化剂的主要原料[2]。
图1均苯四甲酸的结构式
Fig.1 The structure of Pyromellitic acid
均苯四甲酸是一种十分重要的化工原料，其脱水产生的均苯四甲酸二酐[3]，简称均酐，它因具有特殊的结构而被广泛应用。它能做成许多具有优越的耐热性、电绝缘性和耐化学药品性的产品[4]。均苯四甲酸主要来源于均苯四甲酸和均苯四甲酸二酐的生产和提纯过程，在均苯四甲酸二酐的提纯过程中会产生高浓度的芳香酸废水，其主要成分中就包含均苯四甲酸[5]。
可以采用在常压下的气相中通过1,2,4,5四烷基苯的选择性氧化来制备均苯四甲酸二酐。将含有1,2,4,5四烷基苯的气态进料流以4,00012,000 hr?1的空间速度通过空气，以空气中的分子氧作为氧化剂发生选择性氧化，并在300450℃的温度下脱水产生均苯四甲酸二酐[6]。
均苯四甲酸二酐结构式特殊，它含有四个对称的羧基，这样特殊的结构让它能够具有很多其他苯羧酸所没有的特殊性能。其主要用途如下：
1、耐热聚合物。聚酰亚胺的原料中最必不可少的原料之一就是均酐。
2、增塑剂。聚氯乙烯耐热增塑剂的原料之一就有均苯四甲酸二酐，它还常被用于生产医用、食用方面的聚氯乙烯制品。
3、环氧树脂固化剂。大型的绝缘性固件需要靠均酐来做固化剂，均酐还具有快速粘接的性能，因此可以制作成耐冲击性瞬时胶粘剂。
4、均酐和高碳醇进行分步酯化反应可制得具有生物降解性能的“绿色”表面活化剂或乳化剂。还可以用作水处理剂、金属缓蚀剂、皮革鞣剂的添加剂、柴油的低温性能改进剂、电子摄影色调改善剂以及制耐高温润滑剂等[4]。
5、生产消光剂。均酐（四酸）和环丙醚反应制造的消光剂效果好、强度高、不易泛黄，主要用于粉末涂料[7]。
微生物降解被认为是降低均苯四甲酸对环境的影响的最好途径，也是最重要的途径之一，不同微生物对不同染污物能通过氧化、水解、脱羧等不同方式对其进行降解。目前能够收集到的关于利微生物降解均苯四甲酸的资料非常有限，说明大家对均苯四甲酸降解菌研究不多。
近年来随着我国经济的持续上升与发展，均苯四甲酸和均苯四甲酸二酐作为重要的化工原料其生产量与使用量也日渐增长。伴随二者生产量和使用量一起增长的还有在它们的生产、使用过程中产生的均苯四甲酸高浓度废水。这些废水具有高COD值、pH值低、可生化性差等特点，这些也都是均苯四甲酸废水处理的重点和难点[8]。
为了弥补目前均苯四甲酸降解菌研究的匮乏，本实验将从活性污泥中分离一种能够高效降解均苯四甲酸的菌株，然后对其降解特性和生长特性进行研究。
第二章 均苯四甲酸降解菌的分离与鉴定
2.1 材料与方法
2.1.1 实验药品及配方
无机盐培养基（g.L1）：NaCl 1.0，(NH4)2SO4 1.0，K2HPO4.7H2O 1.96，KH2PO4 0.5，MgSO4.7H2O 0.2，去离子水补足至1000 ml，pH 7.0~7.2，固体培养基为加入琼脂20g/L（即2.0g/100ml）；在121℃下灭菌20min。
LB培养基（g.L1）：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，去离子水补足至1000 ml，pH 7.0~7.2；固体培养基为加入琼脂20g/L（即2.0g/100ml）；在121℃下灭菌20min。
富集培养基：将均苯四甲酸按需求浓度加入液体无机盐培养基中，固体培养基为加入琼脂20g/L（即2.0g/100ml）；在121℃下灭菌20min。
PBS缓冲液（g.L1）：NaCl 8.0，KCl 0.2，Na2HPO4 1.44，K2HPO4 0.24，去离子水补足至1000 ml，pH 7.5；在121℃下灭菌20min。
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