植物内生细菌对pahs污染的群体响应
植物可以吸收土壤中的多环芳烃（PAHs）类化合物并在植物体内累积。本实验利用传统的微生物培养方法研究了PAHs污染区植物看麦娘和酢浆草体内内生细菌对PAHs污染的群体响应。明确了不同PAHs污染条件下植物内生细菌的数量、种群多样性及优势种群，并初步了解了植物内生细菌对PAHs污染强度变化所做出的响应，为具有PAHs降解功能的内生细菌筛选提供了基础，并为利用植物内生细菌规避作物有机污染风险提供依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基2
1.2 实验方法2
1.2.1 土壤样品PAHs含量测定2
1.2.2 植物体内PAHs含量测定2
1.2.3 植物内生细菌分离2
1.2.4 菌株鉴定3
1.2.5 植物内生细菌种群特性与PAHs含量之间的关系3
2 结果与分析3
2.1 不同采样区植物体内PAHs含量3
2.2 不同采样区植物可培养内生细菌种群数量3
2.3 植物内生细菌对PAHs污染的群体响应4
3 讨论5
致谢5
参考文献5
植物内生细菌对PAHs污染的群体响应
引言
引言：我国土壤有机污染严重。其中多环芳烃（PAHs）是土壤环境中常见的一类有机污染物[13]，多环芳烃(PAHs)类化合物是由2个或2个以上稠合苯环组成的，其疏水性强、难于降解、易在土壤中累积，PAHs还具有“三致效应”。由于土壤中的PAHs类化合物能够被植物吸收，并可通过食物链富集，从而危害农产品安全和人群健康[4,5]。
目前植物微生物联合修复成为土壤有机污染修复领域的研究热点，其兼具植物修复与微生物修复的优点。而在PAHs污染土壤的植物微生物联合修复的研究则主要侧重植物与专性降解菌的联合修复以及植物与菌根的联合修复。但是前一种容易受到环境条件的影响，后一种需要根据不同的环境条件以找到最佳的组合， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
因此比较费时间[6]。
植物内生细菌是定殖在植物体内并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物，在长期的协同进化过程中，与植物形成了互惠互利的关系。其与土壤微生物相比，一方面，植物内生细菌能有效地在植物体内定殖，不易受外界环境的影响，还可以分泌一些活性物质来促进植物生长、促进植物对污染物的吸收转化、提高植物的耐受性，并降解植物体内的PAHs从而减轻对植物的毒害作用；另一方面，植物为植物内生细菌提供了生存场所和大量营养，以植物内生细菌的生长繁殖，而且植物也可以产生一些疏水物质提高植物内生细菌对多环芳烃的亲和力。因此研究植物内生细菌对PAHs污染的响应，可为筛选具有PAHs降解功能的植物内生细菌提供依据，并为利用功能内生细菌调控植物对PAHs的吸收提供理论基础[7,8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集：采自南京江宁扬子石化芳烃厂排污口的新鲜看麦娘植株和酢浆草以及土壤，冷冻干燥保存。
1.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.2—7.4.（固体培养基加1.5%的琼脂）。
1.2 实验方法
1.2.1 土壤样品PAHs含量测定
称取3g冷冻干燥后过筛(20目)的土样于25mL玻璃离心管中，加入10mL二氯甲烷提取液，超声萃取1h后于4000r/min离心20min，移取3mL上清液过2g硅胶柱，用11mL1：1的二氯甲烷与正己烷洗脱，后经旋转蒸发仪40蒸干，用乙腈定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜，HPLC测定[9]。
1.2.2 植物体内PAHs含量测定
称取一定量的植物样品，充分粉碎后置于25mL的玻璃离心管中。向样品中加入30mL 1：1的丙酮和正己烷溶液进行超声萃取，分3次，每次加入10mL混合液、超声萃取30min；萃取液过含无水硫酸钠和硅胶各2g的层析柱，然后用1:1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液经旋转蒸发仪蒸干后用乙腈定容到2mL，再过0.22μm微孔滤膜，HPLC测定[9]。
1.2.3 植物内生细菌分离
植株表面消毒：植物用自来水冲洗净后在超净台内用75%酒精漂洗3~5min，再用无菌水冲洗3~4次，0.1%HgCl2溶液漂洗2~5min，无菌水再冲洗数次，将经表面消毒的植物样品移入牛肉膏蛋白胨固体平板上，28°C培养24h后，检查平板上是否有细菌生长，将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水进行充分研磨。
内生细菌的分离培养：充分研磨后，取上清液梯度稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，28°C培养3d。待菌落长出，利用平板划线分离纯化出各内生细菌菌株。
1.2.4 菌株鉴定
利用菌体形态观察、生理生化试验并结合16S rDNA序列同源性分析对分离纯化的内生细菌菌株进行鉴定，确定其分类地位[10,11]。菌株生理生化特性测定参照文献进行[12]。采用细菌DNA提取试剂盒(Axygen公司，美国)提取各菌株的DNA，并利用PCR扩增(Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应)其16S rDNA，扩增产物送于南京金思瑞科技有限公司测序，所获测序结果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中与相关的16S rDNA序列进行同源性比对分析。
1.2.5 植物内生细菌种群特性与PAHs含量之间的关系
利用统计软件SPSS和Microsoft Excel 2007对数据进行统计分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基2
1.2 实验方法2
1.2.1 土壤样品PAHs含量测定2
1.2.2 植物体内PAHs含量测定2
1.2.3 植物内生细菌分离2
1.2.4 菌株鉴定3
1.2.5 植物内生细菌种群特性与PAHs含量之间的关系3
2 结果与分析3
2.1 不同采样区植物体内PAHs含量3
2.2 不同采样区植物可培养内生细菌种群数量3
2.3 植物内生细菌对PAHs污染的群体响应4
3 讨论5
致谢5
参考文献5
植物内生细菌对PAHs污染的群体响应
引言
引言：我国土壤有机污染严重。其中多环芳烃（PAHs）是土壤环境中常见的一类有机污染物[13]，多环芳烃(PAHs)类化合物是由2个或2个以上稠合苯环组成的，其疏水性强、难于降解、易在土壤中累积，PAHs还具有“三致效应”。由于土壤中的PAHs类化合物能够被植物吸收，并可通过食物链富集，从而危害农产品安全和人群健康[4,5]。
目前植物微生物联合修复成为土壤有机污染修复领域的研究热点，其兼具植物修复与微生物修复的优点。而在PAHs污染土壤的植物微生物联合修复的研究则主要侧重植物与专性降解菌的联合修复以及植物与菌根的联合修复。但是前一种容易受到环境条件的影响，后一种需要根据不同的环境条件以找到最佳的组合， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
因此比较费时间[6]。
植物内生细菌是定殖在植物体内并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物，在长期的协同进化过程中，与植物形成了互惠互利的关系。其与土壤微生物相比，一方面，植物内生细菌能有效地在植物体内定殖，不易受外界环境的影响，还可以分泌一些活性物质来促进植物生长、促进植物对污染物的吸收转化、提高植物的耐受性，并降解植物体内的PAHs从而减轻对植物的毒害作用；另一方面，植物为植物内生细菌提供了生存场所和大量营养，以植物内生细菌的生长繁殖，而且植物也可以产生一些疏水物质提高植物内生细菌对多环芳烃的亲和力。因此研究植物内生细菌对PAHs污染的响应，可为筛选具有PAHs降解功能的植物内生细菌提供依据，并为利用功能内生细菌调控植物对PAHs的吸收提供理论基础[7,8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集：采自南京江宁扬子石化芳烃厂排污口的新鲜看麦娘植株和酢浆草以及土壤，冷冻干燥保存。
1.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.2—7.4.（固体培养基加1.5%的琼脂）。
1.2 实验方法
1.2.1 土壤样品PAHs含量测定
称取3g冷冻干燥后过筛(20目)的土样于25mL玻璃离心管中，加入10mL二氯甲烷提取液，超声萃取1h后于4000r/min离心20min，移取3mL上清液过2g硅胶柱，用11mL1：1的二氯甲烷与正己烷洗脱，后经旋转蒸发仪40蒸干，用乙腈定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜，HPLC测定[9]。
1.2.2 植物体内PAHs含量测定
称取一定量的植物样品，充分粉碎后置于25mL的玻璃离心管中。向样品中加入30mL 1：1的丙酮和正己烷溶液进行超声萃取，分3次，每次加入10mL混合液、超声萃取30min；萃取液过含无水硫酸钠和硅胶各2g的层析柱，然后用1:1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱；洗脱液经旋转蒸发仪蒸干后用乙腈定容到2mL，再过0.22μm微孔滤膜，HPLC测定[9]。
1.2.3 植物内生细菌分离
植株表面消毒：植物用自来水冲洗净后在超净台内用75%酒精漂洗3~5min，再用无菌水冲洗3~4次，0.1%HgCl2溶液漂洗2~5min，无菌水再冲洗数次，将经表面消毒的植物样品移入牛肉膏蛋白胨固体平板上，28°C培养24h后，检查平板上是否有细菌生长，将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水进行充分研磨。
内生细菌的分离培养：充分研磨后，取上清液梯度稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，28°C培养3d。待菌落长出，利用平板划线分离纯化出各内生细菌菌株。
1.2.4 菌株鉴定
利用菌体形态观察、生理生化试验并结合16S rDNA序列同源性分析对分离纯化的内生细菌菌株进行鉴定，确定其分类地位[10,11]。菌株生理生化特性测定参照文献进行[12]。采用细菌DNA提取试剂盒(Axygen公司，美国)提取各菌株的DNA，并利用PCR扩增(Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应)其16S rDNA，扩增产物送于南京金思瑞科技有限公司测序，所获测序结果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中与相关的16S rDNA序列进行同源性比对分析。
1.2.5 植物内生细菌种群特性与PAHs含量之间的关系
利用统计软件SPSS和Microsoft Excel 2007对数据进行统计分析。
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