n乙烯基吡咯烷酮降解菌的分离与鉴定及降解特性研究
摘要：N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）是一种典型的含氮杂环化合物（NHCs），其广泛用于化工生产当中，如医药，粘合剂，化妆品等工业。NVP在生产及应用过程中会不可避免的进入环境中，难以去除。并且由于NVP具有毒性，致畸性和致突变性，会对环境造成非常大的危害。本文从活性污泥中筛选出了一株NVP降解菌，经鉴定，该菌为节杆菌。通过进行试验确定了其生长曲线，以及该降解菌的最适降解条件。菌株接种在培养基之后经过6个小时的停滞期之后开始进入对数生长期，大约32小时之后，菌株开始进入稳定期，在56小时之后，菌株进入了衰退期，此时培养基中细菌的数量开始减少。通过试验得出其最适温度为25-30℃，最适pH为7-8，最适NaCl浓度为7g/L，在以上这些条件下能得到最好的降解效率。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 试剂与仪器 2
1．2 培养基组成 2
1．3 NVP降解菌的富集和分离 2
1．4 菌株特征和生理生化指标测定 3
1．5 16S rDNA扩增和序列测定及同源性比较 3
1．6 NVP浓度的测定 3
1．7 菌悬液的制备 3
2 结果与分析 3
2．1 NVP降解菌的形态及生理生化特征 3
2．2 NVP降解菌的鉴定 4
2. 3 菌株PZ1在LB培养基中的生长曲线 5
2. 4 温度对菌株PZ1降解NVP的影响 5
2. 5 NaCl浓度对菌株PZ1降解NVP的影响 6
2. 6 pH对菌株PZ1降解NVP的影响 7
2. 7 接种量对菌株PZ1降解NVP的影响 7
2. 8 菌株PZ1 对NVP的利用的生长降解曲线 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
N乙烯基吡咯烷酮降解菌的分离与鉴定及降解特性研究
引言
现如今，由于工业的高速发展，越来越多的化工原料、成品、废料等进入水体，对
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
水体造成了严重的污染，各种各样的污染物进入水体，并难以降解，使得人类自身的生存与健康受到威胁。本文所研究的污染物，N乙烯基吡咯烷酮（NVP）是一种典型的含氮杂环化合物（NHCs），化学式如图1，易聚合成聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能与水及乙醇、乙醚等有机溶剂混溶，相对密度为1.04[1]。聚乙烯基吡咯烷酮易溶于水，作为高分子化合物，用途非常广泛，是增稠剂、分散剂、洗涤剂、胶粘剂和乳化剂等；同时在高分子加工合成、农药、涂料、感光材料、纺织印染、颜料、造纸和采油泥浆等诸多领域有着重要的用途[2]。由于NVP的理化性质，其广泛用于化工生产当中，如医药，粘合剂，化妆品等工业[3]。但是，NVP在生产及应用过程中会不可避免的进入环境中，由于其可与水混溶，因而难以去除。并且由于NVP具有毒性，致畸性和致突变性，还被IARC归类为3类致癌物质。美国ACGIH TWA 中规定N乙烯基吡咯烷酮的接触极限为0.05 ppm。N乙烯基吡咯烷酮对皮肤和粘膜有刺激作用,肝毒素的,可能会影响某些外周血参数[4]。因此，NVP不仅会对环境造成非常大的危害，对于人类与其他动物的健康也带来了非常大的威胁。
由于NVP用途广泛，因而在现阶段世界各国对于NVP的使用量都非常巨大，欧美一些国家年需求量甚至高达一万吨以上[5]，由于我国对NVP的研究与使用相对较晚，因而使用量相对较小，但我国对NVP的需求量正在逐年递加，因此由NVP引起的环境问题不容小觑。但是，目前国内外对于NVP的降解的研究几乎没有，所以需要引起一定的重视。
虽然现在全世界对于NVP的需求量及使用量正在不断增大，由于NVP的大量使用所带来的环境问题也会愈发严重，然而目前对于NVP的降解没有特别好的处理方法。若采用物理方法或化学方法，则成本较高且易造成二次污染，不易管理，可能会达不到工业化大量处理的要求。而采用生物的方法则更加节约成本，易于管理，不易形成二次污染，且处理效果也会更好。NVP作为一种含氮杂环化合物，不易被大多数种类的细菌所利用降解，因而需要通过实验来筛选和富集具有高效率的NVP降解菌。
本实验采用的污泥样品是来自于江苏的一个制药厂。将污泥用含有一定量NVP的无机盐培养基进行驯化，一段时间后进行转接。经过4次转接之后涂布至平板，经过不停地平板划线后分离筛选出一株降解性能最好的PZ1菌株。之后对此菌株进行了鉴定并测试了菌株PZ1的生理生化特征。并且还测试了各种环境条件如温度，初始pH，接种浓度等对菌株PZ1对NVP的降解效率的影响，从而得到了最合适的NVP降解环境。
图1.NVP结构式
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
主要试剂：污泥采自江苏的一个制药厂，N乙烯基吡咯烷酮（NVP）购买自阿拉丁化工有限公司（纯度大于99%），甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。
主要仪器：高效液相色谱仪：SPD20A，SHIMADZU，Japan；紫外可见光分光光度计：JH752；离心机：eppendorf5418.
1．2 培养基组成
用于NVP降解菌分离与培养的无机盐培养基：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 1.5g，NaCl 1.0g，MgSO4 0.2g，pH 7.2，无菌水1000mL;无机固体培养基中添加2%琼脂。
用于富集NVP降解菌的LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5.0g，NaCl 10g，pH 7.2,无菌水1000mL
用于制备菌悬液的磷酸盐缓冲液（PBS）：Na2HPO4 1.44g, K2HPO4 0.24g,KCl 0.2g ,NaCl 8.0g。
1．3 NVP降解菌的富集和分离
取50mL污泥样品加入1L含NVP的无机培养基中进行驯化，用陶瓷曝气器进行曝气。待菌驯化好后，将3mL培养液接入到含100mL无机盐培养基的250mL锥形瓶中放入摇床进行富集培养，其中，无机盐培养基中含有200mg/l的NVP，摇床培养条件为30℃，160r/min。以四天为一个培养周期，转接4次。将得到的富集培养液进行稀释，涂布至无机固体培养基（含500mg/l的NVP）上进行分离纯化，置于30℃培养箱中培养6天。得到的平板上长满了各种菌落，挑取各个菌落进行平板划线，从而得到2株纯化菌株。将得到的菌株分别接入含100mL无机盐培养基（含有200mg/l的NVP）的250mL锥形瓶中，置于摇床（30℃，160r/min）培养2天。用高效液相色谱法测培养液中的NVP浓度，比较两个菌株的降解性能，将降解性能更好的菌株命名为PZ1，以菌株PZ1进行试验。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 试剂与仪器 2
1．2 培养基组成 2
1．3 NVP降解菌的富集和分离 2
1．4 菌株特征和生理生化指标测定 3
1．5 16S rDNA扩增和序列测定及同源性比较 3
1．6 NVP浓度的测定 3
1．7 菌悬液的制备 3
2 结果与分析 3
2．1 NVP降解菌的形态及生理生化特征 3
2．2 NVP降解菌的鉴定 4
2. 3 菌株PZ1在LB培养基中的生长曲线 5
2. 4 温度对菌株PZ1降解NVP的影响 5
2. 5 NaCl浓度对菌株PZ1降解NVP的影响 6
2. 6 pH对菌株PZ1降解NVP的影响 7
2. 7 接种量对菌株PZ1降解NVP的影响 7
2. 8 菌株PZ1 对NVP的利用的生长降解曲线 8
3 讨论 9
致谢 9
参考文献 10
N乙烯基吡咯烷酮降解菌的分离与鉴定及降解特性研究
引言
现如今，由于工业的高速发展，越来越多的化工原料、成品、废料等进入水体，对
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
水体造成了严重的污染，各种各样的污染物进入水体，并难以降解，使得人类自身的生存与健康受到威胁。本文所研究的污染物，N乙烯基吡咯烷酮（NVP）是一种典型的含氮杂环化合物（NHCs），化学式如图1，易聚合成聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能与水及乙醇、乙醚等有机溶剂混溶，相对密度为1.04[1]。聚乙烯基吡咯烷酮易溶于水，作为高分子化合物，用途非常广泛，是增稠剂、分散剂、洗涤剂、胶粘剂和乳化剂等；同时在高分子加工合成、农药、涂料、感光材料、纺织印染、颜料、造纸和采油泥浆等诸多领域有着重要的用途[2]。由于NVP的理化性质，其广泛用于化工生产当中，如医药，粘合剂，化妆品等工业[3]。但是，NVP在生产及应用过程中会不可避免的进入环境中，由于其可与水混溶，因而难以去除。并且由于NVP具有毒性，致畸性和致突变性，还被IARC归类为3类致癌物质。美国ACGIH TWA 中规定N乙烯基吡咯烷酮的接触极限为0.05 ppm。N乙烯基吡咯烷酮对皮肤和粘膜有刺激作用,肝毒素的,可能会影响某些外周血参数[4]。因此，NVP不仅会对环境造成非常大的危害，对于人类与其他动物的健康也带来了非常大的威胁。
由于NVP用途广泛，因而在现阶段世界各国对于NVP的使用量都非常巨大，欧美一些国家年需求量甚至高达一万吨以上[5]，由于我国对NVP的研究与使用相对较晚，因而使用量相对较小，但我国对NVP的需求量正在逐年递加，因此由NVP引起的环境问题不容小觑。但是，目前国内外对于NVP的降解的研究几乎没有，所以需要引起一定的重视。
虽然现在全世界对于NVP的需求量及使用量正在不断增大，由于NVP的大量使用所带来的环境问题也会愈发严重，然而目前对于NVP的降解没有特别好的处理方法。若采用物理方法或化学方法，则成本较高且易造成二次污染，不易管理，可能会达不到工业化大量处理的要求。而采用生物的方法则更加节约成本，易于管理，不易形成二次污染，且处理效果也会更好。NVP作为一种含氮杂环化合物，不易被大多数种类的细菌所利用降解，因而需要通过实验来筛选和富集具有高效率的NVP降解菌。
本实验采用的污泥样品是来自于江苏的一个制药厂。将污泥用含有一定量NVP的无机盐培养基进行驯化，一段时间后进行转接。经过4次转接之后涂布至平板，经过不停地平板划线后分离筛选出一株降解性能最好的PZ1菌株。之后对此菌株进行了鉴定并测试了菌株PZ1的生理生化特征。并且还测试了各种环境条件如温度，初始pH，接种浓度等对菌株PZ1对NVP的降解效率的影响，从而得到了最合适的NVP降解环境。
图1.NVP结构式
1 材料与方法
1．1 试剂与仪器
主要试剂：污泥采自江苏的一个制药厂，N乙烯基吡咯烷酮（NVP）购买自阿拉丁化工有限公司（纯度大于99%），甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。
主要仪器：高效液相色谱仪：SPD20A，SHIMADZU，Japan；紫外可见光分光光度计：JH752；离心机：eppendorf5418.
1．2 培养基组成
用于NVP降解菌分离与培养的无机盐培养基：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 1.5g，NaCl 1.0g，MgSO4 0.2g，pH 7.2，无菌水1000mL;无机固体培养基中添加2%琼脂。
用于富集NVP降解菌的LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5.0g，NaCl 10g，pH 7.2,无菌水1000mL
用于制备菌悬液的磷酸盐缓冲液（PBS）：Na2HPO4 1.44g, K2HPO4 0.24g,KCl 0.2g ,NaCl 8.0g。
1．3 NVP降解菌的富集和分离
取50mL污泥样品加入1L含NVP的无机培养基中进行驯化，用陶瓷曝气器进行曝气。待菌驯化好后，将3mL培养液接入到含100mL无机盐培养基的250mL锥形瓶中放入摇床进行富集培养，其中，无机盐培养基中含有200mg/l的NVP，摇床培养条件为30℃，160r/min。以四天为一个培养周期，转接4次。将得到的富集培养液进行稀释，涂布至无机固体培养基（含500mg/l的NVP）上进行分离纯化，置于30℃培养箱中培养6天。得到的平板上长满了各种菌落，挑取各个菌落进行平板划线，从而得到2株纯化菌株。将得到的菌株分别接入含100mL无机盐培养基（含有200mg/l的NVP）的250mL锥形瓶中，置于摇床（30℃，160r/min）培养2天。用高效液相色谱法测培养液中的NVP浓度，比较两个菌株的降解性能，将降解性能更好的菌株命名为PZ1，以菌株PZ1进行试验。
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