四环素类抗生素对雌激素降解功能菌降解性能的影响
摘要：雌二醇等雌激素在土水环境中的残留严重威胁人群健康和生态安全。畜禽粪便是环境雌激素醇的重要来源，畜禽粪便中的细菌可以降低雌激素水平，但其中与之共存的抗生素残留则可能影响这些细菌对雌激素的降解性能。本文采用实验室筛选出的一株雌二醇降解功能菌ES2-1，经鉴定是一株鞘脂单胞菌（Novosphingobium sp），以此为例调查了四环素和土霉素两种四环素类抗生素对其降解17β-雌二醇(E2)的影响。研究结果表明，功能菌ES2-1对四环素和土霉素的耐药性较差，生长严重受其抑制。四环素显著抑制了功能菌ES2-1对E2的降解；土霉素在低浓度0.5μg/ml条件下抑制了功能菌ES2-1对E2的降解，而在其高浓度10μg/ml条件下，对ES2-1的毒害作用致使其生长停止，无法降解E2。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验3
1.1材料与试剂 3
1.2实验装置与仪器 3
1.3实验方法 3
1.3.1菌株耐药性实验3
1.3.2 药敏试验（KB法）4
1.3.3 不同培养时间内TCs对功能菌ES21降解E2的影响4
2 结果与讨论5
2.1 ES21的在TCs环境中的最小抑菌浓度5
2.2 ES21的药敏试验结果5
2.3 E2标准曲线的绘制6
2.4 TCs对功能菌ES21降解性能的影响6
2.4.1 四环素对功能菌ES21降解性能的影响6
2.4.2 土霉素对功能菌ES21降解性能的影响7
3结论 10
致谢 10
参考文献11
四环素类抗生素对雌激素降解功能菌降解性能的影响
引言
引言
近年来，伴随生活水平显著提高我国畜禽养殖业实现飞速发展，中大型畜禽饲养厂数量逐渐上涨，畜禽粪便产生量急剧增长。据不完全计算，2003年全国畜禽粪便产生量约为22.1亿吨，其中以猪、牛、鸡和羊等动物的排泄物为主，占畜禽粪便产生量的90%以上；2010年我国畜禽粪便总量高达45
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
亿吨[13]。
畜牧养殖动物正常的生理分泌排泄及饲养过程中大量的使用促生长素，致使畜禽粪便中含有大量的雌激素污染物。在畜禽的肠道作用下，少量雌激素以自由态的形式随粪便排出体外，而绝大多数雌激素则以共轭物的形式通过尿液排出，所以在畜禽排泄物中往往含有高剂量的雌激素。例如，肉鸡鸡粪中17βE2和E1的总含量为1465μg/kg，蛋鸡鸡粪则最高达533μg/kg，新鲜牛粪中的雌激素浓度高达2103μg/kg[4]。在欧盟和美国，每年牲畜产生的雌激素量能够达到82吨[5]。随着畜禽粪便作为肥料施入农田，其中包含的雌激素也一并进入土壤和水体，对生态环境构成潜在威胁。
畜禽粪便的另一个特点就是含有抗生素。抗生素除了用于人类疾病的治疗外，还高频率被用于畜禽和水产养殖业，对动物疾病的预防和治疗及促进动物的生长发育起到重要作用[6]。存在于动物体内的抗生素，仅很少部分能够被其吸收利用，绝大部分抗生素以母体或代谢物的形式被排出。残留在畜禽粪便中较高浓度的抗生素如果不能够被降解而直接进入土壤环境不但会造成土壤污染，还会使土壤中的微生物对抗生素产生一定的耐药性，从而形成新一代的抗性菌群，最终对环境和人类健康造成威胁。随着我国抗生素污染的加剧，其对人类日常生活中各方各面都有着不同程度的影响，四环素类抗生素对人类的危害尤为突出。它主要是通过在人体中富集，对人的骨骼和牙齿有一定的损害[7]。四环素类抗生素（tetracycline antibiotic, TCs）是一类广谱抗生素，包括四环素（tetracycline）、土霉素（oxytetracycline）、金霉素（chlotetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素等，其结构均包括并四苯基本骨架（如图1），对革兰氏阳性菌、阴
图1 TCs的分子结构
Fig.1 The molecular structure of TCs
性菌、滤过性病毒、螺旋体属、立克次体乃至原虫类都有很好的抑制作用，被大量应用于畜禽疾病的防治[8]。在中国，每年畜禽养殖业约投入7000t兽用抗生素作为饲料添加剂，其使用量占世界饲料添加剂中全部抗生素含量的50%，其中四环素类抗生素的生产量与使用量在我国畜禽养殖业中是最大的, 大多数畜牧场饲料中添加的抗生素很难被动物肠胃吸收，70%90%的抗生素以母体化合物的形式随动物排泄物被排出体外，对人体健康和生物生态安全造成严重威胁[913]。
畜禽粪便中的四环素和土霉素极大影响了环境中雌激素降解功能菌的降解性能。在不同浓度条件下，抗生素对雌激素降解功能菌的活性抑制情况不同，不同浓度的四环素类抗生素对雌激素降解功能菌的降解性能有不同程度的影响，菌株对四环素和土霉素的适应能力有所差别。所以，在控制及治理畜禽排泄物中常规污染物的基础上，如何有效控制与消减畜禽粪便中TCs的含量，提高雌激素降解功能菌的降解效率，将是今后畜禽粪便处理与处置无害化和资源化的严峻挑战。
在中国，畜禽养殖业中的粪便产生量十分庞大。但畜禽粪便中所含有的高剂量雌激素和大量抗生素已成为制约畜禽粪便资源化利用的一个重要瓶颈，现阶段急需要发展简便、快速、高效地去除养殖业畜禽粪便中雌激素的可行技术。本实验利用前期研究工作中筛选出的一株雌二醇降解功能菌ES21，研究了抗生素影响雌二醇降解菌ES21降解性能的机制，以及抗生素对雌二醇降解菌ES21降解性能的影响。目的在于优化雌二醇降解功能菌的降解性能，减少抗生素对雌二醇降解功能菌降解性能的影响，从而使雌二醇降解功能菌能够最高效率的降解污染物，减少畜禽粪便（主要是其中所含的雌二醇）对环境水体、土壤和人类健康等的危害。
1 实验
1．1 材料与试剂
功能菌ES21介绍：本实验使用的雌二醇降解功能菌ES21由李舜尧师姐于2015年4月筛出。ES21属于鞘脂单胞菌属（Novosphingobium sp）,能够水解α葡萄糖苷酶，与β半乳糖苷酶反应产生对硝基苯βD半乳糖吡喃糖苷酶，可以利用葡萄糖和阿拉伯糖进行同化反应。功能菌ES21的最适底物浓度是20μg/ml，在适宜条件下菌株的七天降解效率能够达到90%以上。
抗菌药物储备液：四环素（tetracycline 25600μg/ml）、土霉素（oxytetracycline 25600μg/ml）；另配制四环素（tetracycline 10000μg/ml）、土霉素（oxytetracycline 10000μg/ml）用于功能菌ES21对E2的降解实验。配置好的抗生素置于4℃冰箱冷冻保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1实验3
1.1材料与试剂 3
1.2实验装置与仪器 3
1.3实验方法 3
1.3.1菌株耐药性实验3
1.3.2 药敏试验（KB法）4
1.3.3 不同培养时间内TCs对功能菌ES21降解E2的影响4
2 结果与讨论5
2.1 ES21的在TCs环境中的最小抑菌浓度5
2.2 ES21的药敏试验结果5
2.3 E2标准曲线的绘制6
2.4 TCs对功能菌ES21降解性能的影响6
2.4.1 四环素对功能菌ES21降解性能的影响6
2.4.2 土霉素对功能菌ES21降解性能的影响7
3结论 10
致谢 10
参考文献11
四环素类抗生素对雌激素降解功能菌降解性能的影响
引言
引言
近年来，伴随生活水平显著提高我国畜禽养殖业实现飞速发展，中大型畜禽饲养厂数量逐渐上涨，畜禽粪便产生量急剧增长。据不完全计算，2003年全国畜禽粪便产生量约为22.1亿吨，其中以猪、牛、鸡和羊等动物的排泄物为主，占畜禽粪便产生量的90%以上；2010年我国畜禽粪便总量高达45
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
亿吨[13]。
畜牧养殖动物正常的生理分泌排泄及饲养过程中大量的使用促生长素，致使畜禽粪便中含有大量的雌激素污染物。在畜禽的肠道作用下，少量雌激素以自由态的形式随粪便排出体外，而绝大多数雌激素则以共轭物的形式通过尿液排出，所以在畜禽排泄物中往往含有高剂量的雌激素。例如，肉鸡鸡粪中17βE2和E1的总含量为1465μg/kg，蛋鸡鸡粪则最高达533μg/kg，新鲜牛粪中的雌激素浓度高达2103μg/kg[4]。在欧盟和美国，每年牲畜产生的雌激素量能够达到82吨[5]。随着畜禽粪便作为肥料施入农田，其中包含的雌激素也一并进入土壤和水体，对生态环境构成潜在威胁。
畜禽粪便的另一个特点就是含有抗生素。抗生素除了用于人类疾病的治疗外，还高频率被用于畜禽和水产养殖业，对动物疾病的预防和治疗及促进动物的生长发育起到重要作用[6]。存在于动物体内的抗生素，仅很少部分能够被其吸收利用，绝大部分抗生素以母体或代谢物的形式被排出。残留在畜禽粪便中较高浓度的抗生素如果不能够被降解而直接进入土壤环境不但会造成土壤污染，还会使土壤中的微生物对抗生素产生一定的耐药性，从而形成新一代的抗性菌群，最终对环境和人类健康造成威胁。随着我国抗生素污染的加剧，其对人类日常生活中各方各面都有着不同程度的影响，四环素类抗生素对人类的危害尤为突出。它主要是通过在人体中富集，对人的骨骼和牙齿有一定的损害[7]。四环素类抗生素（tetracycline antibiotic, TCs）是一类广谱抗生素，包括四环素（tetracycline）、土霉素（oxytetracycline）、金霉素（chlotetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素等，其结构均包括并四苯基本骨架（如图1），对革兰氏阳性菌、阴
图1 TCs的分子结构
Fig.1 The molecular structure of TCs
性菌、滤过性病毒、螺旋体属、立克次体乃至原虫类都有很好的抑制作用，被大量应用于畜禽疾病的防治[8]。在中国，每年畜禽养殖业约投入7000t兽用抗生素作为饲料添加剂，其使用量占世界饲料添加剂中全部抗生素含量的50%，其中四环素类抗生素的生产量与使用量在我国畜禽养殖业中是最大的, 大多数畜牧场饲料中添加的抗生素很难被动物肠胃吸收，70%90%的抗生素以母体化合物的形式随动物排泄物被排出体外，对人体健康和生物生态安全造成严重威胁[913]。
畜禽粪便中的四环素和土霉素极大影响了环境中雌激素降解功能菌的降解性能。在不同浓度条件下，抗生素对雌激素降解功能菌的活性抑制情况不同，不同浓度的四环素类抗生素对雌激素降解功能菌的降解性能有不同程度的影响，菌株对四环素和土霉素的适应能力有所差别。所以，在控制及治理畜禽排泄物中常规污染物的基础上，如何有效控制与消减畜禽粪便中TCs的含量，提高雌激素降解功能菌的降解效率，将是今后畜禽粪便处理与处置无害化和资源化的严峻挑战。
在中国，畜禽养殖业中的粪便产生量十分庞大。但畜禽粪便中所含有的高剂量雌激素和大量抗生素已成为制约畜禽粪便资源化利用的一个重要瓶颈，现阶段急需要发展简便、快速、高效地去除养殖业畜禽粪便中雌激素的可行技术。本实验利用前期研究工作中筛选出的一株雌二醇降解功能菌ES21，研究了抗生素影响雌二醇降解菌ES21降解性能的机制，以及抗生素对雌二醇降解菌ES21降解性能的影响。目的在于优化雌二醇降解功能菌的降解性能，减少抗生素对雌二醇降解功能菌降解性能的影响，从而使雌二醇降解功能菌能够最高效率的降解污染物，减少畜禽粪便（主要是其中所含的雌二醇）对环境水体、土壤和人类健康等的危害。
1 实验
1．1 材料与试剂
功能菌ES21介绍：本实验使用的雌二醇降解功能菌ES21由李舜尧师姐于2015年4月筛出。ES21属于鞘脂单胞菌属（Novosphingobium sp）,能够水解α葡萄糖苷酶，与β半乳糖苷酶反应产生对硝基苯βD半乳糖吡喃糖苷酶，可以利用葡萄糖和阿拉伯糖进行同化反应。功能菌ES21的最适底物浓度是20μg/ml，在适宜条件下菌株的七天降解效率能够达到90%以上。
抗菌药物储备液：四环素（tetracycline 25600μg/ml）、土霉素（oxytetracycline 25600μg/ml）；另配制四环素（tetracycline 10000μg/ml）、土霉素（oxytetracycline 10000μg/ml）用于功能菌ES21对E2的降解实验。配置好的抗生素置于4℃冰箱冷冻保存。
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