黄瓜根际解淀粉芽孢杆菌亚家族分类及其功能研究
摘要：亲缘辨识能增强亲缘微生物之间的交流与合作。本实验拟利用土壤细菌的多细胞群集运动来研究亲缘辨识现象。我们将一组从黄瓜根际收集的解淀粉芽孢杆菌成对组合进行群集运动，并辅以16S rDNA技术，对其亚家族亲缘关系进行判断；并对与模式菌株SQR9亲缘关系近的菌株进行植酸酶、IAA产量测定等生理生化试验。结果发现绝大多数菌株之间形成边界，而与之相反，融合菌株的保守基因相似度很高。另外，生理生化试验表明所选菌株均有促生效果。因此，群集运动与基因相似度有一定关联性。本实验证明了细菌在多细胞环境的亲缘辨识现象，揭示了其在生态互作时的潜在作用。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keywords 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 实验材料 4
1．1．1 主要仪器 4
1．1．2 主要试剂 4
1．1．3 菌株和培养基 4
1．2 实验方法 5
1．2．1 Swarming平板试验 5
1．2．2 DNA提取及16S扩增试验 5
1．2．2．1 DNA的提取 5
1．2．2．2 16S rRNA的扩增 5
1．2．2．3 PCR产物的清洁回收及验证 5
1．2．2．4 构建系统发育树 5
1．2．3 生理生化试验 5
1．2．3．1 生物膜 5
1．2．3．2 生长曲线 5
1．2．3．3 IAA测定 5
1．2．3．4 植酸酶测定 5
2 结果与分析 5
2．1 所筛菌株展示 6
2．2 Swarming平板试验 7
2．2．1 群集细菌swarming现象 7
2．2．1．1 融合 7
2．2．1．2 半融合 8
2．2．1．3 边界 8
2．2．2 荧光蛋白标记 8
2．2．2．1 融合 9
2．2．2．2 半融合 9
2．2．2．
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3 边界 9
2．3 16S扩增结果及发育树的构建 10
2．3．1 16S扩增 10
2．3．2 系统发育树的构建 10
2．4 Swarming结果与遗传相关性的关系 12
2．5 生理生化试验 14
2．5．1 生物膜形成能力 14
2．5．2 生长曲线 15
2．5．3 IAA测定 15
2．5．4 植酸酶测定 16
3 讨论 16
3．1 边界的形成与否与遗传相关性有关 16
3．2 QXPA群体感应系统 17
致谢 17
参考文献 17
附录 19
黄瓜根际解淀粉芽孢杆菌亚家族分类及其功能研究
引言
生物系统中存在合作关系的如昆虫群落，理论上很容易会因为寄生虫或者其他不速之客而崩溃，但亲缘辨识能保障它们识别出亲族分泌的信号物质，其他生物无法识别和使用[1, 2]。早在1964年汉密尔顿就提出了亲缘选择理论。他认为，亲族之间多合作，并且与亲近程度成正比。也就是说，亲缘关系越近，彼此之间的合作倾向就越强。合作行为有利于相同基因在自然选择中的保存和进化。因此，亲缘选择也就是自然选择在基因层次的一种表现形式[3]。
细菌运动是其亲缘辨识的前提。细菌群落在半固体培养基表面由接种点向周围进行的依赖鞭毛和纤毛的迁移运动称为群集运动(swarming mobility)[4]。近几年来人们对群集运动研究越来越广泛，不断发现有新的细菌具有群集运动能力，以致人们猜测这是具有运动能力的细菌的普遍现象[5]。如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的亲缘辨识机理已得到很好的研究。奇异变形杆菌是一种引起泌尿系统感染的革兰氏阴性病原菌，其基因组成相同的菌往往会相互融合，不同的菌之间往往形成可见边界[6]。再如粘细菌的亲缘辨识现象也得到了类似结果，然而，有些多位点基因序列完全一致的菌株也会出现不相容现象[7]，研究认为这种现象是独立的基因位点修饰进化的结果[1]。另外，枯草芽孢杆菌也是如此，在拟南芥根部接种成对菌株，亲缘菌株在根部共存且形成混合菌株生物膜，非亲缘菌株之间的不相容使得产生的生物膜只有一种菌[8]。
群集运动是细菌在表面迁移速度最快的运动形式。因此在低养分的土壤中，群集细菌能迅速到达营养丰富的环境如植物根部定植形成菌落，因为对于细菌来说，植物分泌物是很好的食物来源[9]。群集运动给细菌提供了很多生物学优势。
本实验通过群集运动试验来研究解淀粉芽孢杆菌在物体表面的亲缘辨识现象。收集了21株从施有生物有机肥的黄瓜根际土中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌，它们之间很有可能相互交流，可以用来研究细菌亲缘辨识。与预期一致，这些菌能进行亲缘识别。具体表现为在swarming培养基上，非亲缘菌株之间存在清晰的边界，这些菌的保守基因相似度不高；与之相反的是保守基因相似度高的菌株之间互相融合。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 主要仪器 灭菌锅、分析天平、实验室超纯水系统、超声波清洗机、药品保存箱、恒温摇床、烘箱、水平电泳仪、水浴锅、低温保存箱、PCR仪、小型高速离心机、高速冷冻离心机、酶标仪、细菌超净台、凝胶成像系统、pH计。
1．1．2 主要试剂 DNA Marker以及6×loading buffer购自Novoprotein公司，PCR引物合成于Gensript公司。DNA提取采用AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒。
Salkowski显色液：称取4.5g氯化铁溶于适量水，缓慢倒入576ml浓硫酸，并用ddH2O定容至1L。
植酸钠溶液：将植酸钠，氯化钙分别溶于0.1M的TrisHCl(pH7.0)中，终浓度均为2mM，测定当天混匀。
终止液：5%(m/V)三氯乙酸，溶剂为水。
显色液：1.5%钼酸铵(溶于5.5%浓硫酸)：2.7%硫酸亚铁=4：1(V:V)，实验前新鲜配制。
磷酸储备液：将适量磷酸二氢钾于105 °C干燥2 h，干燥器内冷却后，准确称取1.369g溶于蒸馏水并稀释定容至100ml，该储备液浓度为100mM。?
1．1．3 菌株与培养基 本实验采用的菌株为实验室保存的从施有生物有机肥的黄瓜根际土中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌。以及解淀粉芽孢杆菌SQR9的野生型和GFP标记的突变体（卡纳抗性kan30）。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠3g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。
Swarming培养基：0.7％琼脂，15mM (NH4)2SO4，8mM MgSO4×7H2O，27mM KCl，7mM柠檬酸钠，50mM TrisHCl，pH7.5，1μM FeSO4×7H2O，10μM MnSO4×4H2O，0.6mM KH2PO4，0.86mM赖氨酸，0.78mM色氨酸，0.2％葡萄糖。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keywords 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 实验材料 4
1．1．1 主要仪器 4
1．1．2 主要试剂 4
1．1．3 菌株和培养基 4
1．2 实验方法 5
1．2．1 Swarming平板试验 5
1．2．2 DNA提取及16S扩增试验 5
1．2．2．1 DNA的提取 5
1．2．2．2 16S rRNA的扩增 5
1．2．2．3 PCR产物的清洁回收及验证 5
1．2．2．4 构建系统发育树 5
1．2．3 生理生化试验 5
1．2．3．1 生物膜 5
1．2．3．2 生长曲线 5
1．2．3．3 IAA测定 5
1．2．3．4 植酸酶测定 5
2 结果与分析 5
2．1 所筛菌株展示 6
2．2 Swarming平板试验 7
2．2．1 群集细菌swarming现象 7
2．2．1．1 融合 7
2．2．1．2 半融合 8
2．2．1．3 边界 8
2．2．2 荧光蛋白标记 8
2．2．2．1 融合 9
2．2．2．2 半融合 9
2．2．2．
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
3 边界 9
2．3 16S扩增结果及发育树的构建 10
2．3．1 16S扩增 10
2．3．2 系统发育树的构建 10
2．4 Swarming结果与遗传相关性的关系 12
2．5 生理生化试验 14
2．5．1 生物膜形成能力 14
2．5．2 生长曲线 15
2．5．3 IAA测定 15
2．5．4 植酸酶测定 16
3 讨论 16
3．1 边界的形成与否与遗传相关性有关 16
3．2 QXPA群体感应系统 17
致谢 17
参考文献 17
附录 19
黄瓜根际解淀粉芽孢杆菌亚家族分类及其功能研究
引言
生物系统中存在合作关系的如昆虫群落，理论上很容易会因为寄生虫或者其他不速之客而崩溃，但亲缘辨识能保障它们识别出亲族分泌的信号物质，其他生物无法识别和使用[1, 2]。早在1964年汉密尔顿就提出了亲缘选择理论。他认为，亲族之间多合作，并且与亲近程度成正比。也就是说，亲缘关系越近，彼此之间的合作倾向就越强。合作行为有利于相同基因在自然选择中的保存和进化。因此，亲缘选择也就是自然选择在基因层次的一种表现形式[3]。
细菌运动是其亲缘辨识的前提。细菌群落在半固体培养基表面由接种点向周围进行的依赖鞭毛和纤毛的迁移运动称为群集运动(swarming mobility)[4]。近几年来人们对群集运动研究越来越广泛，不断发现有新的细菌具有群集运动能力，以致人们猜测这是具有运动能力的细菌的普遍现象[5]。如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的亲缘辨识机理已得到很好的研究。奇异变形杆菌是一种引起泌尿系统感染的革兰氏阴性病原菌，其基因组成相同的菌往往会相互融合，不同的菌之间往往形成可见边界[6]。再如粘细菌的亲缘辨识现象也得到了类似结果，然而，有些多位点基因序列完全一致的菌株也会出现不相容现象[7]，研究认为这种现象是独立的基因位点修饰进化的结果[1]。另外，枯草芽孢杆菌也是如此，在拟南芥根部接种成对菌株，亲缘菌株在根部共存且形成混合菌株生物膜，非亲缘菌株之间的不相容使得产生的生物膜只有一种菌[8]。
群集运动是细菌在表面迁移速度最快的运动形式。因此在低养分的土壤中，群集细菌能迅速到达营养丰富的环境如植物根部定植形成菌落，因为对于细菌来说，植物分泌物是很好的食物来源[9]。群集运动给细菌提供了很多生物学优势。
本实验通过群集运动试验来研究解淀粉芽孢杆菌在物体表面的亲缘辨识现象。收集了21株从施有生物有机肥的黄瓜根际土中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌，它们之间很有可能相互交流，可以用来研究细菌亲缘辨识。与预期一致，这些菌能进行亲缘识别。具体表现为在swarming培养基上，非亲缘菌株之间存在清晰的边界，这些菌的保守基因相似度不高；与之相反的是保守基因相似度高的菌株之间互相融合。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 主要仪器 灭菌锅、分析天平、实验室超纯水系统、超声波清洗机、药品保存箱、恒温摇床、烘箱、水平电泳仪、水浴锅、低温保存箱、PCR仪、小型高速离心机、高速冷冻离心机、酶标仪、细菌超净台、凝胶成像系统、pH计。
1．1．2 主要试剂 DNA Marker以及6×loading buffer购自Novoprotein公司，PCR引物合成于Gensript公司。DNA提取采用AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒。
Salkowski显色液：称取4.5g氯化铁溶于适量水，缓慢倒入576ml浓硫酸，并用ddH2O定容至1L。
植酸钠溶液：将植酸钠，氯化钙分别溶于0.1M的TrisHCl(pH7.0)中，终浓度均为2mM，测定当天混匀。
终止液：5%(m/V)三氯乙酸，溶剂为水。
显色液：1.5%钼酸铵(溶于5.5%浓硫酸)：2.7%硫酸亚铁=4：1(V:V)，实验前新鲜配制。
磷酸储备液：将适量磷酸二氢钾于105 °C干燥2 h，干燥器内冷却后，准确称取1.369g溶于蒸馏水并稀释定容至100ml，该储备液浓度为100mM。?
1．1．3 菌株与培养基 本实验采用的菌株为实验室保存的从施有生物有机肥的黄瓜根际土中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌。以及解淀粉芽孢杆菌SQR9的野生型和GFP标记的突变体（卡纳抗性kan30）。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠3g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。
Swarming培养基：0.7％琼脂，15mM (NH4)2SO4，8mM MgSO4×7H2O，27mM KCl，7mM柠檬酸钠，50mM TrisHCl，pH7.5，1μM FeSO4×7H2O，10μM MnSO4×4H2O，0.6mM KH2PO4，0.86mM赖氨酸，0.78mM色氨酸，0.2％葡萄糖。
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