汉中南郑厚朴内生真菌分离纯化(附件)
摘 要厚朴是现有药用植物中独特的植物之一，属于单科、单属植物，临床常用的厚朴药材，各部分均可入药。目前在我国分布较广。厚朴为多年生落叶乔木，生长时间较长，供药用的需要生长十几年以上，其采集主要是砍树剥皮的方法，这使得厚朴药材和外界环境都遭到前所未有的破坏。因野生资源不断遭到破坏而日益枯竭，被列为我国珍稀植物行列。药用植物内生真菌，可以产生与寄主植物相同或相似的生物活性物质，内生真菌生活在植物体内，与植物体共生，在吸收植物体营养物质的同时也维系着宿主植物正常的生理活性。本实验对陕西汉中南郑县潮水村厚朴内生真菌进行分离、纯化，初步研究厚朴内生真菌的种群多样性。在实验过程中，全部操作流程都利用微生物学方法，从采集的厚朴根、茎中对内生真菌进行分离纯化，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）上对分离得到的内生真菌进行纯化，进而得到纯菌株，置4℃冰箱保存。从厚朴中共分离出24株内生真菌，其中，6株是由茎中分离得到，18株是从根中分离得到的。研究表明：由于根部深入土壤，富含营养物质，故由根中分离得到的内生真菌较茎中的多。本实验通过对厚朴内生真菌的分离纯化，对厚朴内生真菌进行初步研究，为合理利用厚朴药用成分及保护厚朴药用植物资源提供理论依据。丰富了内生真菌菌种资源库，为后续研究提供参考。目 录
1 文献综述
1.1 厚朴的研究现状 1
1.1.1 厚朴植物的简介 1
1.1.2 厚朴化学成分研究 2
1.1.3 厚朴的药理作用 3
1.2 内生真菌研究进展 4
1.2.1 植物内生真菌 4
1.2.2 内生真菌与植物的关系 4
1.2.3 植物内生菌产生活性代谢产物的机制 4
1.3 小结 5
2 实验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 植物材料 7
2.1.2 实验仪器及试剂 7
2.1.3 培养基配制 8
2.2 实验方法 8
2.2.1 内生真菌的分离 8
2.2.2 内生真菌的纯化 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 厚朴中内生真菌的分
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验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 植物材料 7
2.1.2 实验仪器及试剂 7
2.1.3 培养基配制 8
2.2 实验方法 8
2.2.1 内生真菌的分离 8
2.2.2 内生真菌的纯化 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 厚朴中内生真菌的分离、纯化 8
2.3.2 分析讨论 9
结论 10
参考文献 11
致谢 14
文献综述
厚朴的研究现状
厚朴植物的简介
根据《中国植物志》所述，厚朴是我们在研究过程中的常用中药，具有行气燥湿，降逆平喘之功效，为木兰科植物，植物学范围内别名紫朴、紫油朴、川朴、温朴等，是国家二级保护植物及国家三级濒危植物。树皮厚，棕色，没有裂纹，高约20 m。叶大近革质，7~9片叶子长于树枝顶端，叶面整洁或稍有波状边缘。叶柄粗壮，花为白色，具芳香气味。栽培较多的有浙江、福建、四川、湖北、湖南、陕西、贵州等省份，并有少量野生资源。厚朴喜光照，生于海拔300~1500 m的山林，湿度较大，相对湿度较高。栽培于800~1700 m左右的山区，在低海拔区种植幼苗，然后移栽到中海拔地带。广西、江西及浙江，这些地区都在种植厚朴。利用率很高，因为其枝皮、根皮、花、种子及芽均可作为药用，但是用的最多最广的是树皮，为我国特有中药之一。厚朴是传统中医学和日本汉方医学广泛使用的一味药物，临床上多用来治疗细菌感染，炎症和胃肠道疾病[1]。凹叶厚朴与厚朴之间的不同之处在于凹叶厚朴的叶先端凹缺，其他形态特征均相同。厚朴与凹叶厚朴生长环境与习性相同，所以二者总是交错生长。
凹叶厚朴为多年生禾本科植物，为木兰科木兰属植物厚朴的一个亚种[2]，是我国特产树种，主产浙江、福建、四川、湖北、湖南、江西等地，商品习称温朴，产量大[3]，生长周期长，一般要生长十五年以上才能剥皮用，其采集方式主要靠砍树剥皮，这对厚朴资源和生态环境都产生极大的破坏[4]，其濒危情况与厚朴相同，是我国传统的特有珍贵中药材。厚朴性温，可以起到祛湿痰、理气消食的作用，用于抗炎杀菌、胸腹胀满、肠梗阻等[5]。四川是川朴的主要产区，产量占全国总产的10%左右。陕西属于厚朴的边缘产区，主要产于安康、汉中一带。经调查陕西省汉中在秦岭地区，北向有秦岭山脉，南部依着巴山，秦岭山脉为主要山脉，是经典的亚热带季风气候，光照充足，雨热同季，温暖而潮湿，雨量充沛等等。厚朴喜好温暖、湿润气候，这些地理环境条件下所生长出的厚朴品种较优良。在采收树龄上，传统认为厚朴需要生长十几年后才可以使用,一些研究者以厚朴所含的总酚量作为研究指标，考察药材与树龄中厚朴总酚含量的关系[6,7]。《中国药典》对厚朴总酚的含量规定也由1995年版的3%[8]降到了2005年版的2%[9]。由于破坏野生树种资源，促使人们对厚朴大规模栽培，国家建立了浙江景宁，湖北恩施，四川等区域大面积的凹叶厚朴种植基地。但普遍由于选择地方的不当，行距株距过小、落后的技术等一系列问题导致厚朴和凹叶厚朴存活率很低，栽培树种未到采剥树龄就被砍伐破坏，使厚朴及凹叶厚朴的质量与数量不能满足需求。
厚朴化学成分研究
酚类
厚朴中含有多种酚类物质，占厚朴总量的5%左右[10]，厚朴酚与和厚朴酚是厚朴的主要活性成分，利用效率较高和较低的毒性，具有药物分子的发展潜力[11,12]。和厚朴酚是厚朴的两个有效成分之一，与厚朴酚为异构体。很早的时候，人们就探索了厚朴酚的药理作用，此后对它的研究越来越多，而且把研究动物实验的结果应用于治疗相关疾病，且取得了良好的成效。通过对和厚朴酚的毒理学、药物动力学和药物代谢等实验研究，都证明其适合开发成药。国外有的学者在上世纪30年代第一次发现了厚朴酚，并对其的含量进行了测定[13]。虽然对它的研究越来越多，但是由于中药成分的复杂性、不确定性，在临床上，仍然是许多成分混合在一起，单个的应用就很少。虽然厚朴酚在某些领域的确表现出良好的临床疗效，但是只有对其单体做更深层次的基础及临床试验，才能得到国内外学者更高程度的认可，也才能使其的应用前景更为广阔[14]。
因此，加大对厚朴酚与和厚朴酚的研究与开发，不仅能保护中药植物资源，体现中药潜在的价值，而且更会为人类健康带来福音，为社会带来更为深远的经济利益。
挥发油类
厚朴内还有挥发油成分，经GCMS鉴定出48种化合物[15,16]，其中含量最高的为桉叶醇，占挥发油总量的40%~50%，此外还含有1甲基4异丙基酚、胡椒烯、邻异丙基酚、香橙烯、别香橙烯、乙酸龙脑酯、乙酸芳樟醇酯、石竹烯、榄香醇等。通过相关研究表明，厚朴的挥发油成分在不同地区和相对含量的差异，但他们仍在很大程度上决定了药材的相似度不同地区的功效[17,18]。
其他
厚朴提取得到松脂素4OβD吡喃葡萄糖苷[19]，厚朴具有非常强的抗病毒效果[20]、丁香脂素4,4双0βD葡萄糖苷。此外，厚朴中尚含有微量元素钙、钠、钾、镁、铁、锰、锌、铜及少量的皂苷、鞣质等[21]。
厚朴的药理作用
厚朴是一个古老的植物树种，临床上使用频率较高，厚朴酚与和厚朴酚是主要有效成分。两种化合物具有抗菌，抗癌，抗
1 文献综述
1.1 厚朴的研究现状 1
1.1.1 厚朴植物的简介 1
1.1.2 厚朴化学成分研究 2
1.1.3 厚朴的药理作用 3
1.2 内生真菌研究进展 4
1.2.1 植物内生真菌 4
1.2.2 内生真菌与植物的关系 4
1.2.3 植物内生菌产生活性代谢产物的机制 4
1.3 小结 5
2 实验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 植物材料 7
2.1.2 实验仪器及试剂 7
2.1.3 培养基配制 8
2.2 实验方法 8
2.2.1 内生真菌的分离 8
2.2.2 内生真菌的纯化 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 厚朴中内生真菌的分
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验部分
2.1 实验材料 7
2.1.1 植物材料 7
2.1.2 实验仪器及试剂 7
2.1.3 培养基配制 8
2.2 实验方法 8
2.2.1 内生真菌的分离 8
2.2.2 内生真菌的纯化 8
2.3 结果与分析 8
2.3.1 厚朴中内生真菌的分离、纯化 8
2.3.2 分析讨论 9
结论 10
参考文献 11
致谢 14
文献综述
厚朴的研究现状
厚朴植物的简介
根据《中国植物志》所述，厚朴是我们在研究过程中的常用中药，具有行气燥湿，降逆平喘之功效，为木兰科植物，植物学范围内别名紫朴、紫油朴、川朴、温朴等，是国家二级保护植物及国家三级濒危植物。树皮厚，棕色，没有裂纹，高约20 m。叶大近革质，7~9片叶子长于树枝顶端，叶面整洁或稍有波状边缘。叶柄粗壮，花为白色，具芳香气味。栽培较多的有浙江、福建、四川、湖北、湖南、陕西、贵州等省份，并有少量野生资源。厚朴喜光照，生于海拔300~1500 m的山林，湿度较大，相对湿度较高。栽培于800~1700 m左右的山区，在低海拔区种植幼苗，然后移栽到中海拔地带。广西、江西及浙江，这些地区都在种植厚朴。利用率很高，因为其枝皮、根皮、花、种子及芽均可作为药用，但是用的最多最广的是树皮，为我国特有中药之一。厚朴是传统中医学和日本汉方医学广泛使用的一味药物，临床上多用来治疗细菌感染，炎症和胃肠道疾病[1]。凹叶厚朴与厚朴之间的不同之处在于凹叶厚朴的叶先端凹缺，其他形态特征均相同。厚朴与凹叶厚朴生长环境与习性相同，所以二者总是交错生长。
凹叶厚朴为多年生禾本科植物，为木兰科木兰属植物厚朴的一个亚种[2]，是我国特产树种，主产浙江、福建、四川、湖北、湖南、江西等地，商品习称温朴，产量大[3]，生长周期长，一般要生长十五年以上才能剥皮用，其采集方式主要靠砍树剥皮，这对厚朴资源和生态环境都产生极大的破坏[4]，其濒危情况与厚朴相同，是我国传统的特有珍贵中药材。厚朴性温，可以起到祛湿痰、理气消食的作用，用于抗炎杀菌、胸腹胀满、肠梗阻等[5]。四川是川朴的主要产区，产量占全国总产的10%左右。陕西属于厚朴的边缘产区，主要产于安康、汉中一带。经调查陕西省汉中在秦岭地区，北向有秦岭山脉，南部依着巴山，秦岭山脉为主要山脉，是经典的亚热带季风气候，光照充足，雨热同季，温暖而潮湿，雨量充沛等等。厚朴喜好温暖、湿润气候，这些地理环境条件下所生长出的厚朴品种较优良。在采收树龄上，传统认为厚朴需要生长十几年后才可以使用,一些研究者以厚朴所含的总酚量作为研究指标，考察药材与树龄中厚朴总酚含量的关系[6,7]。《中国药典》对厚朴总酚的含量规定也由1995年版的3%[8]降到了2005年版的2%[9]。由于破坏野生树种资源，促使人们对厚朴大规模栽培，国家建立了浙江景宁，湖北恩施，四川等区域大面积的凹叶厚朴种植基地。但普遍由于选择地方的不当，行距株距过小、落后的技术等一系列问题导致厚朴和凹叶厚朴存活率很低，栽培树种未到采剥树龄就被砍伐破坏，使厚朴及凹叶厚朴的质量与数量不能满足需求。
厚朴化学成分研究
酚类
厚朴中含有多种酚类物质，占厚朴总量的5%左右[10]，厚朴酚与和厚朴酚是厚朴的主要活性成分，利用效率较高和较低的毒性，具有药物分子的发展潜力[11,12]。和厚朴酚是厚朴的两个有效成分之一，与厚朴酚为异构体。很早的时候，人们就探索了厚朴酚的药理作用，此后对它的研究越来越多，而且把研究动物实验的结果应用于治疗相关疾病，且取得了良好的成效。通过对和厚朴酚的毒理学、药物动力学和药物代谢等实验研究，都证明其适合开发成药。国外有的学者在上世纪30年代第一次发现了厚朴酚，并对其的含量进行了测定[13]。虽然对它的研究越来越多，但是由于中药成分的复杂性、不确定性，在临床上，仍然是许多成分混合在一起，单个的应用就很少。虽然厚朴酚在某些领域的确表现出良好的临床疗效，但是只有对其单体做更深层次的基础及临床试验，才能得到国内外学者更高程度的认可，也才能使其的应用前景更为广阔[14]。
因此，加大对厚朴酚与和厚朴酚的研究与开发，不仅能保护中药植物资源，体现中药潜在的价值，而且更会为人类健康带来福音，为社会带来更为深远的经济利益。
挥发油类
厚朴内还有挥发油成分，经GCMS鉴定出48种化合物[15,16]，其中含量最高的为桉叶醇，占挥发油总量的40%~50%，此外还含有1甲基4异丙基酚、胡椒烯、邻异丙基酚、香橙烯、别香橙烯、乙酸龙脑酯、乙酸芳樟醇酯、石竹烯、榄香醇等。通过相关研究表明，厚朴的挥发油成分在不同地区和相对含量的差异，但他们仍在很大程度上决定了药材的相似度不同地区的功效[17,18]。
其他
厚朴提取得到松脂素4OβD吡喃葡萄糖苷[19]，厚朴具有非常强的抗病毒效果[20]、丁香脂素4,4双0βD葡萄糖苷。此外，厚朴中尚含有微量元素钙、钠、钾、镁、铁、锰、锌、铜及少量的皂苷、鞣质等[21]。
厚朴的药理作用
厚朴是一个古老的植物树种，临床上使用频率较高，厚朴酚与和厚朴酚是主要有效成分。两种化合物具有抗菌，抗癌，抗
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