不同提取方法对铁皮石斛多糖组成、结构及抗氧化活性的影响
目 录
1 引言 1
1.1 多糖的提取 1
1.2 多糖的纯化 1
1.3 多糖的构效研究 2
1.4 课题研究的内容及目的 2
2 实验方法 3
2.1 实验材料 3
2.2 石斛多糖的不同提取工艺 4
2.3 多糖组成的测定 5
2.4 多糖结构的测定 8
2.5 抗氧化活性的测定 9
3 结果与分析 10
3.1 多糖含量测定结果比较 10
3.2 硫酸基含量测定结果比较 12
3.3 糖醛酸含量测定结果比较 13
3.4 分子量测定结果比较 14
3.5 红外光谱结果与分析 15
3.6 紫外全波长扫描结果与分析 18
3.7 电镜扫描观察结果 19
3.8 抗氧化活性比较 20
结论 24
致谢 25
参考文献 26
1 引言
铁皮石斛属兰科，干品又称铁皮枫斗，药用历史悠久，是我国传统的名贵中药，自古就有“药中黄金、救命仙草”之美誉[1]。石斛茎中含有多种生物碱、多糖、氨基酸及淀粉等，石斛多糖作为主要活性成分，在免疫、降血糖以及防癌、抗癌、抗衰老等方面的药理作用使其得到广泛研究。本文以铁皮石斛为研究对象，探讨水榨法、乙醇榨、水榨残渣、乙醇榨残渣、冻融超声法、液氮冷冻粉碎法6种不同提取方法对石斛多糖组成、结构、及抗氧化活性的影响[2]
1.1 多糖的提取
目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法[3~5]、超滤法、超声法、微波法、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
超临界流体萃取法[6~8]。赵纪峰等[9]认为水提醇沉法是用来提取多糖的最常用方法之一，可以热水浸提也可冷水浸提。用得较多的是热水浸提。周振鸣[10]和叶余原[11]都进行了超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究，考察了提取温度、固液比、提取时间和超声频率4个因素对铁皮石斛多糖提取得率的影响。超声提取法的多糖得率大于常规水提法，更加高效，具有提取时间短、方法简单、收率高且无需加热等优点[12,13]。
1.2 多糖的纯化
1.2.1 多糖脱蛋白方法
采用乙醇等有机溶剂沉淀得到粗多糖，其中含有的蛋白质较多，需要进行脱蛋白。脱蛋白的方法有经典的Sevage法、三氯乙酸法、酶解法等。
植物多糖用TCA法脱蛋白。 三氯乙酸法，即滴加三氯乙酸至多糖溶液中，直到溶液出现浑浊为止，停止滴加三氯乙酸，然后离心，取上清液即为脱蛋白多糖溶液[14]。若采用此法，务必选择适量的三氯乙酸。因为三氯乙酸的浓度与蛋白清除率及多糖损失率有关[15~18]。
1.2.2 多糖的分级纯化
分离多糖的方法有分级分步沉淀法、超滤法[19]、大孔树脂法、柱层析法等。分级分步沉淀法适用于各种溶解度相差较大的多糖，但其消耗乙醇多，而且醇沉时挥发损耗。超滤法是一种膜分离法，与分子大小有关，操作条件温和，不使用化学试剂，不破坏热敏物质[20~22]。
大孔树脂法[23~25]是近几年发展起来的用于分离纯化多糖的新方法，大孔树脂种类繁多、条件温和、不破坏活性成分、具有机械稳定性高、再生简便，价格低廉等优点。大孔树脂法分离纯化所得的多糖纯度较高，但其存在的不足之处是不宜处理粘度大，色素含量高的样品。柱层析法包括离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换柱层析是根据被分离物质的粒子所带电性不同。被分离物质的带电粒子与离子交换剂上的反离子进行交换，通过改变洗脱溶剂的pH值，将混合物中的多种组分依次逐个洗脱下来。DEAE-纤维素是使用最多的一种离子交换层析，它不仅能使多糖脱色[26]，还可以分离多糖。凝胶柱层析的介质是多孔性网状结构的物质，一般有凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，具有分子筛效应，但不适合分离粘多糖。赵凤春[27]采用X-5吸附树脂分离纯化黄芪提取液中的黄芪多糖，省去了传统溶剂萃取法的烦琐工艺，仅吸附-脱附一步工艺即可提高多糖含量、成本低、操作简单，易于工业化生产。
赵宇等[28]将海蒿子多糖粗品溶于少量蒸馏水中，离心，上清液加入DEAE-SephadexA-25层析柱NaCl溶液梯度洗脱收集得到两种均一性多糖。高义霞等[29]将经脱蛋白、脱色后的沙蒿多糖用ultrahydrogelTM500 (718 mm×300 mm)层析分离纯化，0.1 mol/L磷酸缓冲液洗脱，在凝胶色谱中出现单一而对称的峰，纯化效果好、纯度高。
1.3 多糖的构效研究
多糖因具有抗肿瘤、抗衰老及降血糖等药理作用，已成为医药界研究的热点[30]。分光光度分析是根据物质的吸收光谱研究物质的成分，结构[31]及物质间相互作用的手段[32,33]。每种物质都有其特有的，固定的吸收光谱曲线，可以根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低来判断或测定该物质的含量。高校液相色谱仪主要用于分离生物、医学相关的生物大分子，天然化合物；气相色谱用于难以分离的不易挥发和热稳定性差的化合物。傅里叶红外变换光谱仪用于 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
化学组分的分析和分子立体构型的判断。电镜扫描可以用于观察试样表面形貌特征。通过紫外、红外、高效液相、电镜等，可以了解铁皮石斛多糖组成、结构及其抗氧化活性。
1.4 课题研究的内容及目的
1.4.1 课题研究的目的
研究不同的提取方法对石斛多糖的组成，结构和抗氧化活性的影响。
1.4.2 课题研究的内容
本实验采用水榨法、乙醇榨、水榨残渣法、醇榨残渣法、冻融超声法，液氮冷冻粉碎法提取石斛粗多糖。通过苯酚-硫酸法测定多糖的含糖量，硫酸钡比浊法测定多糖的硫酸基含量，硫酸-咔唑法测定多糖的糖醛酸含量。通过空间色谱排阻法测定其分子量；通过紫外分光光度计全波长扫描测定其是否含有多糖和蛋白质；通过傅里叶变换红外光谱仪确定其是否有多糖的特征基团；通过电镜扫描观察其表面形貌特征。通过DPPH、H2O2、还原力验证及比较抗氧化活性。
2 实验方法
2.1 实验材料
2.1.1 材料与试剂
实验中所需的具体试剂与材料见表1。
表1 实验所需材料与试剂
名称 规格 生产厂家
铁皮石斛 广州中医药大学
硫酸 分析纯 莱阳市康德化工有限公司
苯酚 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
DPPH溶液 分析纯 南京奥佳化工有限公司
H2O2溶液 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
无水乙醇 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
碳酸钡 分析纯 上海凌峰化学试剂有限公司
咔唑 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
2.2.1 水榨
选用50 g新鲜铁皮石斛，剪成2 cm左右的小段，放入榨汁机内，加人1500 mL纯净水。启动榨汁机，并设定时间为10 min，观察到石斛彻底搅碎，榨汁液均匀时，停止榨汁，倒出石斛榨汁液，离心，收集残渣。再将上清液减压浓缩到三分之一体积，随后缓慢加入无水乙醇进行醇沉脱色，快速用玻璃棒搅拌，使其形成絮状沉淀。离心后，去除上清液，收集沉淀。把得到的多糖沉淀放入-80 ℃冰箱预冻24 h。取出预冻后的粗多糖，观察是否冻结实。打开冷冻干燥机，预冻到-40 ℃，放入样品冷冻干燥6 h，然后取出放入干燥箱。
1 引言 1
1.1 多糖的提取 1
1.2 多糖的纯化 1
1.3 多糖的构效研究 2
1.4 课题研究的内容及目的 2
2 实验方法 3
2.1 实验材料 3
2.2 石斛多糖的不同提取工艺 4
2.3 多糖组成的测定 5
2.4 多糖结构的测定 8
2.5 抗氧化活性的测定 9
3 结果与分析 10
3.1 多糖含量测定结果比较 10
3.2 硫酸基含量测定结果比较 12
3.3 糖醛酸含量测定结果比较 13
3.4 分子量测定结果比较 14
3.5 红外光谱结果与分析 15
3.6 紫外全波长扫描结果与分析 18
3.7 电镜扫描观察结果 19
3.8 抗氧化活性比较 20
结论 24
致谢 25
参考文献 26
1 引言
铁皮石斛属兰科，干品又称铁皮枫斗，药用历史悠久，是我国传统的名贵中药，自古就有“药中黄金、救命仙草”之美誉[1]。石斛茎中含有多种生物碱、多糖、氨基酸及淀粉等，石斛多糖作为主要活性成分，在免疫、降血糖以及防癌、抗癌、抗衰老等方面的药理作用使其得到广泛研究。本文以铁皮石斛为研究对象，探讨水榨法、乙醇榨、水榨残渣、乙醇榨残渣、冻融超声法、液氮冷冻粉碎法6种不同提取方法对石斛多糖组成、结构、及抗氧化活性的影响[2]
1.1 多糖的提取
目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法[3~5]、超滤法、超声法、微波法、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
超临界流体萃取法[6~8]。赵纪峰等[9]认为水提醇沉法是用来提取多糖的最常用方法之一，可以热水浸提也可冷水浸提。用得较多的是热水浸提。周振鸣[10]和叶余原[11]都进行了超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究，考察了提取温度、固液比、提取时间和超声频率4个因素对铁皮石斛多糖提取得率的影响。超声提取法的多糖得率大于常规水提法，更加高效，具有提取时间短、方法简单、收率高且无需加热等优点[12,13]。
1.2 多糖的纯化
1.2.1 多糖脱蛋白方法
采用乙醇等有机溶剂沉淀得到粗多糖，其中含有的蛋白质较多，需要进行脱蛋白。脱蛋白的方法有经典的Sevage法、三氯乙酸法、酶解法等。
植物多糖用TCA法脱蛋白。 三氯乙酸法，即滴加三氯乙酸至多糖溶液中，直到溶液出现浑浊为止，停止滴加三氯乙酸，然后离心，取上清液即为脱蛋白多糖溶液[14]。若采用此法，务必选择适量的三氯乙酸。因为三氯乙酸的浓度与蛋白清除率及多糖损失率有关[15~18]。
1.2.2 多糖的分级纯化
分离多糖的方法有分级分步沉淀法、超滤法[19]、大孔树脂法、柱层析法等。分级分步沉淀法适用于各种溶解度相差较大的多糖，但其消耗乙醇多，而且醇沉时挥发损耗。超滤法是一种膜分离法，与分子大小有关，操作条件温和，不使用化学试剂，不破坏热敏物质[20~22]。
大孔树脂法[23~25]是近几年发展起来的用于分离纯化多糖的新方法，大孔树脂种类繁多、条件温和、不破坏活性成分、具有机械稳定性高、再生简便，价格低廉等优点。大孔树脂法分离纯化所得的多糖纯度较高，但其存在的不足之处是不宜处理粘度大，色素含量高的样品。柱层析法包括离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换柱层析是根据被分离物质的粒子所带电性不同。被分离物质的带电粒子与离子交换剂上的反离子进行交换，通过改变洗脱溶剂的pH值，将混合物中的多种组分依次逐个洗脱下来。DEAE-纤维素是使用最多的一种离子交换层析，它不仅能使多糖脱色[26]，还可以分离多糖。凝胶柱层析的介质是多孔性网状结构的物质，一般有凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，具有分子筛效应，但不适合分离粘多糖。赵凤春[27]采用X-5吸附树脂分离纯化黄芪提取液中的黄芪多糖，省去了传统溶剂萃取法的烦琐工艺，仅吸附-脱附一步工艺即可提高多糖含量、成本低、操作简单，易于工业化生产。
赵宇等[28]将海蒿子多糖粗品溶于少量蒸馏水中，离心，上清液加入DEAE-SephadexA-25层析柱NaCl溶液梯度洗脱收集得到两种均一性多糖。高义霞等[29]将经脱蛋白、脱色后的沙蒿多糖用ultrahydrogelTM500 (718 mm×300 mm)层析分离纯化，0.1 mol/L磷酸缓冲液洗脱，在凝胶色谱中出现单一而对称的峰，纯化效果好、纯度高。
1.3 多糖的构效研究
多糖因具有抗肿瘤、抗衰老及降血糖等药理作用，已成为医药界研究的热点[30]。分光光度分析是根据物质的吸收光谱研究物质的成分，结构[31]及物质间相互作用的手段[32,33]。每种物质都有其特有的，固定的吸收光谱曲线，可以根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低来判断或测定该物质的含量。高校液相色谱仪主要用于分离生物、医学相关的生物大分子，天然化合物；气相色谱用于难以分离的不易挥发和热稳定性差的化合物。傅里叶红外变换光谱仪用于 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
化学组分的分析和分子立体构型的判断。电镜扫描可以用于观察试样表面形貌特征。通过紫外、红外、高效液相、电镜等，可以了解铁皮石斛多糖组成、结构及其抗氧化活性。
1.4 课题研究的内容及目的
1.4.1 课题研究的目的
研究不同的提取方法对石斛多糖的组成，结构和抗氧化活性的影响。
1.4.2 课题研究的内容
本实验采用水榨法、乙醇榨、水榨残渣法、醇榨残渣法、冻融超声法，液氮冷冻粉碎法提取石斛粗多糖。通过苯酚-硫酸法测定多糖的含糖量，硫酸钡比浊法测定多糖的硫酸基含量，硫酸-咔唑法测定多糖的糖醛酸含量。通过空间色谱排阻法测定其分子量；通过紫外分光光度计全波长扫描测定其是否含有多糖和蛋白质；通过傅里叶变换红外光谱仪确定其是否有多糖的特征基团；通过电镜扫描观察其表面形貌特征。通过DPPH、H2O2、还原力验证及比较抗氧化活性。
2 实验方法
2.1 实验材料
2.1.1 材料与试剂
实验中所需的具体试剂与材料见表1。
表1 实验所需材料与试剂
名称 规格 生产厂家
铁皮石斛 广州中医药大学
硫酸 分析纯 莱阳市康德化工有限公司
苯酚 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
DPPH溶液 分析纯 南京奥佳化工有限公司
H2O2溶液 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
无水乙醇 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
碳酸钡 分析纯 上海凌峰化学试剂有限公司
咔唑 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
2.2.1 水榨
选用50 g新鲜铁皮石斛，剪成2 cm左右的小段，放入榨汁机内，加人1500 mL纯净水。启动榨汁机，并设定时间为10 min，观察到石斛彻底搅碎，榨汁液均匀时，停止榨汁，倒出石斛榨汁液，离心，收集残渣。再将上清液减压浓缩到三分之一体积，随后缓慢加入无水乙醇进行醇沉脱色，快速用玻璃棒搅拌，使其形成絮状沉淀。离心后，去除上清液，收集沉淀。把得到的多糖沉淀放入-80 ℃冰箱预冻24 h。取出预冻后的粗多糖，观察是否冻结实。打开冷冻干燥机，预冻到-40 ℃，放入样品冷冻干燥6 h，然后取出放入干燥箱。
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