不同产地莲子心水提物HPLC指纹图谱的研究
目 录
1 引言 1
1.1 莲子心的研究进展 1
1.1.1 药效研究 1
1.1.2 化学成分研究 3
1.1.3 质量控制研究 5
1.2 HPLC在中药指纹图谱中的研究概述 5
1.3 本文研究内容与意义 6
2 不同产地莲子心HPLC指纹图谱研究 6
2.1 药品及试剂 6
2.2 试验仪器 7
2.3 试验方法 7
2.3.1 色谱条件考察 7
2.3.2 供试品溶液的制备 8
2.3.3 对照品溶液的制备 8
2.3.4 测定方法 8
2.3.5 方法学考察 8
2.3.6 样品测定 9
2.4 结果 10
2.5 讨论 11
结论 12
致谢 13
参考文献 14
1 引言
1.1 莲子心的研究进展
1.1.1 药效研究
莲为多年生水生草本，于水泽、池塘、湖沼或水田内的静水中生长，野生或栽培皆可，其中以莲子播种最多[1]。莲藕分为花莲、籽莲和藕莲三大类，以采收莲子心为主要目的的主要栽培品种为籽莲，籽莲以采收莲籽为目的。莲子心在我国主产于湖南、湖北、江西、福建、江苏、浙江等省，其在中亚、西亚、北美、印度、中国、日本等亚热带和温带地区也有出产[2]。
莲子心为睡莲科植物莲成熟种子中的干燥幼叶和胚根，是我国一种历史悠久的天然保健品，莲子心几乎具有广谱的保健作用，早在《本草纲目》中就记载它能“清心去热”。从我国多部药典中我们还以看到莲子心具有清心 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
安神、交通心肾、止血抗炎、止咳化痰等功效[3]，随着科研工作的不断深入，现代药理研究已经逐渐揭开了莲子心具有诸多保健功能的奥秘，莲子心中多种保健组分各自的保健功能已在人体和动物试验中逐渐被证实。我国科技工作者对它的研究一直没有中断，随着研究工作的深入，莲子心的主要保健组分已逐渐被揭晓，它的保健功能也越来越多地被发现。因此，对莲子心中有效保健组分的分离提取及分析检测的研究工作，也在药学、食品等学科不断展开，而且新成果不断，特别在近十年来，有关莲子心的研究成果更时有报道[4]。
降压作用：从莲子心中提取的莲心碱有短时的降压作用， 而莲心季铵碱具有强而持久的降压作用[5]。甲基莲心碱能有效降低各种动物的血压， 随剂量增加而作用加强， 作用时间也延长。椎动脉及脑室内注射甲基莲心碱的实验结果表明， 甲基莲心碱不是神经节阻断剂。甲基莲心碱对降低舒张压的作用明显大于收缩压。甲基莲心碱的降压作用可能是直接扩张血管平滑肌所致[6]。
抗心率失常作用：异莲心碱可对抗多种实验性心律失常，且可能与阻滞Ca2 + 、Na+通道有关[7]。有人研究了异莲心碱对豚鼠牵张性心律失常的作用[8]。发现异莲心碱能降低心脏的自搏频率和左室压，高剂量异莲心碱5μmol/L作用已具有显著性意义，链霉素200mol/L无明显作用[9]。莲心碱对心肌慢反应动作电位及慢反应内向电流有影响， 可浓度依赖性地降低离体兔窦房结起搏细胞慢反应跨膜电位0相幅度(APAO)和最大上升速度(Vmax)， 延长窦性心动周期(SCL)， 增大离体兔窦房结起搏细胞及高钾诱发的豚鼠乳头肌慢反应APA0和Vmax， 还可浓度依赖地抑制犬蒲氏纤维慢内向电流， 使慢内向电流下降[10]。甲基莲心碱可明显抑制培养大鼠心室肌细胞INa， 还能使豚鼠心室肌细胞INa及ICa-l明显下降， 抑制INa稳态外向K+电流和ICa-l和I-V曲线并使后者的峰值电流电位略右移[11]。以上表明，莲子心能抑制Na+、Ca2+、K+的跨膜转运，而产生协同的抗心律失常作用[12]。
抗氧化作用：王辉等[13]对异莲心碱的体外抗氧化活性进行了研究。他们考察了异莲心碱在体外对超氧阴离子自由基(O2-)、羟自由基(OH)的清除作用和对OH 诱导的脂质过氧化的影响，并发现不同浓度异莲心碱对O2-均有清除作用，且呈量效关系，EC50为0.90mg/mL;对OH有较强的清除作用，且呈量效关系， EC50为1.82 mg/mL;对脂质过氧化有抑制作用，且呈量效关系，EC50为0.47mg/mL。同时他们也研究了异莲心碱对大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响[14]。用异莲心碱与肝匀浆共同温育后，发现异莲心碱可明显抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.01)，这种抑制作用在0.08～1.28g/L范围内呈浓度依赖性变化，IC50为0.67g/L。将大鼠肝匀浆经过VitC-Fe的诱导氧化，氧化产物MDA的生成量显著增加，异莲心碱不同浓度与肝匀浆共同温育后可显著抑制MDA的生成量(P<0.01)， 且呈良好的量效关系，IC50为1.05g/L[9]。
对脑缺血/再灌注损伤的保护作用：徐俊英等[15]研究了异莲心碱对实验性脑缺血损伤的保护作用， 结果发现，异莲心碱可以剂量依赖性地改善大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠神经系统损伤症状， 减小梗死体积占全脑体积比(%)， 说明异莲心碱对实验性脑缺血损伤具有保护作用。接着， 他们又进一步研究了异莲心碱对实验性前脑缺血/再灌注损伤的保护机制[16]，结果发现， I/R损伤术前给予异莲心碱能剂量依赖性地使脑组织MDA生成减少， ROS含量明显下降，同时异莲心碱能增强SOD、Ca2+-ATPase 和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性。推测异莲心碱对脑I/R的保护作用可能与它抗氧化和抗自由基损伤，保护细胞和线粒体ATP依赖性钙泵活性， 缓解[Ca2+]i和[Ca2+]m的超载有关[9]。
改善急性肺损伤及肺纤维化：汤国想等[17]研究了异莲心碱对小鼠急性肺损伤及肺纤维化的保护作用。发现异莲心碱能够改善肺炎引起的间质增厚和炎症反应以及肺纤维化所引起的正常肺泡细胞的严重增生和死亡；能剂量信赖性地抑制PQ诱导的SOD的减少， MDA和Hyp的增加；能够抑制转化生长因子(TGF-β1)和基质金属蛋白酶(MMP-2)的过度表达。提示异莲心碱既能抑制脂质的氧化，也能抗炎症反应[9]。
抗肿瘤：应用流式细胞术、TUNEL法、改良MTT比色法和WesternBlot法等现代生物学研究手段，新发现了莲子心生物碱具有较好的抗癌作用。莲心碱能逆转内皮素所致的3H-TdR掺入量增多，阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G1/M期)，并能逆转内皮素引起的原癌基因相关抗原及mRNA的表达增强，P53抑癌基因相关抗原及mRNA表达减弱[18]。甲基莲心碱能逆转MCF-7/Adr细胞的凋亡抗性， 其作用机制可能与抑制P-gp的功能和表达、增加ADR在MCF-7/Adr细胞内的积累有关[19]。甲基莲心碱能增强长春新碱诱导人胃癌细胞凋亡， 推测其为一种低毒高效的化疗增敏剂[20]。
抗脂质过氧化及清除自由基作用：甲基莲心碱具有抗氧自由基作用， 能抑制肝细胞脂质过氧化。甲基莲心碱清除超氧阴离子的效应虽小于SOD，但清除羟自由基的效应则比典型的羟自由基清除剂甘露醇还要强，说明甲基莲心碱以清除氧自由基为主，而对氧自由基产生过程的影响较小。这可能是甲基莲心碱分子结构上的酚羟基上的氢直接与氧自由基结合而产生抗氧化作用[21]。
1 引言 1
1.1 莲子心的研究进展 1
1.1.1 药效研究 1
1.1.2 化学成分研究 3
1.1.3 质量控制研究 5
1.2 HPLC在中药指纹图谱中的研究概述 5
1.3 本文研究内容与意义 6
2 不同产地莲子心HPLC指纹图谱研究 6
2.1 药品及试剂 6
2.2 试验仪器 7
2.3 试验方法 7
2.3.1 色谱条件考察 7
2.3.2 供试品溶液的制备 8
2.3.3 对照品溶液的制备 8
2.3.4 测定方法 8
2.3.5 方法学考察 8
2.3.6 样品测定 9
2.4 结果 10
2.5 讨论 11
结论 12
致谢 13
参考文献 14
1 引言
1.1 莲子心的研究进展
1.1.1 药效研究
莲为多年生水生草本，于水泽、池塘、湖沼或水田内的静水中生长，野生或栽培皆可，其中以莲子播种最多[1]。莲藕分为花莲、籽莲和藕莲三大类，以采收莲子心为主要目的的主要栽培品种为籽莲，籽莲以采收莲籽为目的。莲子心在我国主产于湖南、湖北、江西、福建、江苏、浙江等省，其在中亚、西亚、北美、印度、中国、日本等亚热带和温带地区也有出产[2]。
莲子心为睡莲科植物莲成熟种子中的干燥幼叶和胚根，是我国一种历史悠久的天然保健品，莲子心几乎具有广谱的保健作用，早在《本草纲目》中就记载它能“清心去热”。从我国多部药典中我们还以看到莲子心具有清心 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
安神、交通心肾、止血抗炎、止咳化痰等功效[3]，随着科研工作的不断深入，现代药理研究已经逐渐揭开了莲子心具有诸多保健功能的奥秘，莲子心中多种保健组分各自的保健功能已在人体和动物试验中逐渐被证实。我国科技工作者对它的研究一直没有中断，随着研究工作的深入，莲子心的主要保健组分已逐渐被揭晓，它的保健功能也越来越多地被发现。因此，对莲子心中有效保健组分的分离提取及分析检测的研究工作，也在药学、食品等学科不断展开，而且新成果不断，特别在近十年来，有关莲子心的研究成果更时有报道[4]。
降压作用：从莲子心中提取的莲心碱有短时的降压作用， 而莲心季铵碱具有强而持久的降压作用[5]。甲基莲心碱能有效降低各种动物的血压， 随剂量增加而作用加强， 作用时间也延长。椎动脉及脑室内注射甲基莲心碱的实验结果表明， 甲基莲心碱不是神经节阻断剂。甲基莲心碱对降低舒张压的作用明显大于收缩压。甲基莲心碱的降压作用可能是直接扩张血管平滑肌所致[6]。
抗心率失常作用：异莲心碱可对抗多种实验性心律失常，且可能与阻滞Ca2 + 、Na+通道有关[7]。有人研究了异莲心碱对豚鼠牵张性心律失常的作用[8]。发现异莲心碱能降低心脏的自搏频率和左室压，高剂量异莲心碱5μmol/L作用已具有显著性意义，链霉素200mol/L无明显作用[9]。莲心碱对心肌慢反应动作电位及慢反应内向电流有影响， 可浓度依赖性地降低离体兔窦房结起搏细胞慢反应跨膜电位0相幅度(APAO)和最大上升速度(Vmax)， 延长窦性心动周期(SCL)， 增大离体兔窦房结起搏细胞及高钾诱发的豚鼠乳头肌慢反应APA0和Vmax， 还可浓度依赖地抑制犬蒲氏纤维慢内向电流， 使慢内向电流下降[10]。甲基莲心碱可明显抑制培养大鼠心室肌细胞INa， 还能使豚鼠心室肌细胞INa及ICa-l明显下降， 抑制INa稳态外向K+电流和ICa-l和I-V曲线并使后者的峰值电流电位略右移[11]。以上表明，莲子心能抑制Na+、Ca2+、K+的跨膜转运，而产生协同的抗心律失常作用[12]。
抗氧化作用：王辉等[13]对异莲心碱的体外抗氧化活性进行了研究。他们考察了异莲心碱在体外对超氧阴离子自由基(O2-)、羟自由基(OH)的清除作用和对OH 诱导的脂质过氧化的影响，并发现不同浓度异莲心碱对O2-均有清除作用，且呈量效关系，EC50为0.90mg/mL;对OH有较强的清除作用，且呈量效关系， EC50为1.82 mg/mL;对脂质过氧化有抑制作用，且呈量效关系，EC50为0.47mg/mL。同时他们也研究了异莲心碱对大鼠肝匀浆脂质过氧化的影响[14]。用异莲心碱与肝匀浆共同温育后，发现异莲心碱可明显抑制丙二醛(MDA)的生成(P<0.01)，这种抑制作用在0.08～1.28g/L范围内呈浓度依赖性变化，IC50为0.67g/L。将大鼠肝匀浆经过VitC-Fe的诱导氧化，氧化产物MDA的生成量显著增加，异莲心碱不同浓度与肝匀浆共同温育后可显著抑制MDA的生成量(P<0.01)， 且呈良好的量效关系，IC50为1.05g/L[9]。
对脑缺血/再灌注损伤的保护作用：徐俊英等[15]研究了异莲心碱对实验性脑缺血损伤的保护作用， 结果发现，异莲心碱可以剂量依赖性地改善大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠神经系统损伤症状， 减小梗死体积占全脑体积比(%)， 说明异莲心碱对实验性脑缺血损伤具有保护作用。接着， 他们又进一步研究了异莲心碱对实验性前脑缺血/再灌注损伤的保护机制[16]，结果发现， I/R损伤术前给予异莲心碱能剂量依赖性地使脑组织MDA生成减少， ROS含量明显下降，同时异莲心碱能增强SOD、Ca2+-ATPase 和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性。推测异莲心碱对脑I/R的保护作用可能与它抗氧化和抗自由基损伤，保护细胞和线粒体ATP依赖性钙泵活性， 缓解[Ca2+]i和[Ca2+]m的超载有关[9]。
改善急性肺损伤及肺纤维化：汤国想等[17]研究了异莲心碱对小鼠急性肺损伤及肺纤维化的保护作用。发现异莲心碱能够改善肺炎引起的间质增厚和炎症反应以及肺纤维化所引起的正常肺泡细胞的严重增生和死亡；能剂量信赖性地抑制PQ诱导的SOD的减少， MDA和Hyp的增加；能够抑制转化生长因子(TGF-β1)和基质金属蛋白酶(MMP-2)的过度表达。提示异莲心碱既能抑制脂质的氧化，也能抗炎症反应[9]。
抗肿瘤：应用流式细胞术、TUNEL法、改良MTT比色法和WesternBlot法等现代生物学研究手段，新发现了莲子心生物碱具有较好的抗癌作用。莲心碱能逆转内皮素所致的3H-TdR掺入量增多，阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G1/M期)，并能逆转内皮素引起的原癌基因相关抗原及mRNA的表达增强，P53抑癌基因相关抗原及mRNA表达减弱[18]。甲基莲心碱能逆转MCF-7/Adr细胞的凋亡抗性， 其作用机制可能与抑制P-gp的功能和表达、增加ADR在MCF-7/Adr细胞内的积累有关[19]。甲基莲心碱能增强长春新碱诱导人胃癌细胞凋亡， 推测其为一种低毒高效的化疗增敏剂[20]。
抗脂质过氧化及清除自由基作用：甲基莲心碱具有抗氧自由基作用， 能抑制肝细胞脂质过氧化。甲基莲心碱清除超氧阴离子的效应虽小于SOD，但清除羟自由基的效应则比典型的羟自由基清除剂甘露醇还要强，说明甲基莲心碱以清除氧自由基为主，而对氧自由基产生过程的影响较小。这可能是甲基莲心碱分子结构上的酚羟基上的氢直接与氧自由基结合而产生抗氧化作用[21]。
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