水稻缺磷响应基因oswrkyp4的突变体鉴定及其功能的初步验证
摘要：磷（Phosphorus, P）是植物生长发育必需的大量营养元素之一，是许多生物大分子的重要组成部分，并且广泛参与植物体内各种生化合成、能量转移和信号转导等过程。植物对缺磷环境的适应机制都是由其背后一系列精巧的分子机制作为支撑。为了进一步补充完善水稻磷素调控网络，本研究鉴定并克隆了水稻WRKY家族转录因子基因，将其命名为OsWRKY-P4。实验室前期结果表明，WRKY-P4是一个定位在细胞核的转录因子，并且受缺磷明显下调。而本次课题主要对已获得的水稻OsWRKY-P4的CRISPR突变体材料进行分子水平鉴定，并对其在不同磷水平条件下的表型进了分析和生理指标测定。实验结果表明，OsWRKY-P4的三个CRISPR突变体株系在DNA水平上均发生了突变，且均为纯合体。在高磷条件下，突变体植株比野生型略微矮小，且生物量明显减少，叶片中的可提取磷含量明显高于WT，根部中的可提取磷含量也有略微的提高。但在低磷条件下，突变体植株与野生型水稻之间表型上没有明显差异，但叶片中的可提取磷含量高于野生型。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1植物材料 3
1.2氨基酸序列对比分析 3
1.3水稻缺素处理3
1.4水稻DNA提取鉴定3
1.5水稻根部RNA抽提反转录反应以及半定量测定4
1.5.1 RNA抽提4
1.5.2 RNA反转录反应以及半定量测定4
1.6可溶性磷浓度测定4
1.6.1 试剂配制4
1.6.2 操作步骤4
1.6.3磷标准曲线的制作4
1.6.4 计算4
2结果5
2.1 OsWRKYP4的基因结构的分析5
2.2 WRKY家族进化树分析5
2.3OsWRKYP4亚细胞定位分析6
2.4OsWRKYP4对缺磷胁迫的响应6
2.5OsWRKYP4的CRISPR突变体材料的鉴定6
2.6OsWRKYP4突变体材料在不同磷水平下的表型分析及生理
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
数据测定7
3讨论9
致谢10
参考文献11
附录A RNA反转录反应以及cDNA合成12
图1.1WRKYP4基因结构5
图1.2 OsWRKYP4氨基酸序列5
图1.3进化树分析5
图1.4亚细胞定位6
图1.5A&B6
图1.6测序结果7
图1.7ABC8
图1.8ABC8
图1.9A&B9
水稻缺磷响应基因OsWRKYP4的突变体鉴定及其功能的初步验证
引言
引言
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，大米是全球板书以上人口的主食。我国水稻种植面积是世界上最多的，占世界水稻种植面积的20%，大米产量占我国粮食总产的44%，是保证我国粮食安全的最重要的作物。
在植物生长发育过程中磷是不可或缺的大量元素，同时也是许多生物大分子的重要组成部分[12]，在农田和自然生态系统中土壤中磷元素的缺乏是限制植物生长发育的关键因素之一。并且广泛参与植物体内各种生化合成、能量转移和信号转导等过程[3]。然而，由于磷容易固定和沉淀在土壤中，所以土壤溶液中磷的浓度一般情况只有110μM，因此在农田及自然生态系统中磷也常常成为植物生长的主要限制因子之一[3]。
综上所述，土壤中磷的生物有效性往往很低，而作物高产优质需要大量的磷，但我国所有
约80%的磷肥进入土壤与水系成为作物无效态磷，使土壤中的磷含量不断增加。过量的化肥投入，不但使我国成为世界上单位化肥投入增加最多、粮食产出最低的国家之一，并且直接导致化肥成本增加、水体富营养化、土壤酸化及磷矿等不可再生资源消耗加剧等一系列问题。据统计，在未来几十年内全球低成本的磷矿资源将被耗竭[45]
。因此，培育磷高效的高产优质作物品种，开发土壤磷库继而大幅度提高磷肥的利用效率具有重大的社会与经济意义，同时符合国家“化肥减量提效”这个需求。
在漫长的进化过程中植物已经形成了一套以适应缺磷环境的形态变化及生理生化改变，其中包括根系构型的改变、酸性磷酸酶及有机酸的分泌、与丛枝菌根真菌形成共生体系等等。所有这些机制都是由一些列复杂精巧的分子机制进行调控的[6]。而在最近几年，科学研究者们在该科学领域针对这些分子机制进行了了大量的科学研究，初步构建了植物缺磷信号转导途径的分子调控网络。虽然如此，多数科学研究主要集中在模式作物拟南芥身上，而水稻缺磷信号转导途径的分子调控网络更为复杂，所以仍可以对许多磷酸盐转运蛋白（PT）的上游转录因子进行探索研究。这些复杂的机制又是由一系列精巧的分子机制来调控的。迄今植物缺磷信号转导途径方面的研究已初步构建了该途径分子调控网络的轮廓。其中，转录因子起着关键性的调控作用[7]。
编码蛋白的基因的表达调控可以在多个水平进行，即转录水平，转录后水平，翻译水平及翻译后水平。所以不管是编码蛋白的基因还是非编码RNA等不编码蛋白的基因，转录水平的表达调控在基因功能及形态的进化过程中起着关键性作用[8]。转录因子调控基因的转录活性的方式是与下游基因启动子区域的cisacting element结合，。而转录因子编码的蛋白具有两个特征结构，即DNA结合结构域（DBD, DNABinding Domain）和转录活性的调控结构（RD, Regulatory Domain）。所以通过对转录因子不同特征的研究，它们被归类到不同的转录因子家族，如MYB，WRKY，bHLH、MADS，GRAS等。通过对下游靶基因的调控，这些转录因子在植物生长发育以及各种生物或非生物胁迫等过程中起着至关重要的作用。[9]
PHR (PhosphateStarvation Response) 在已鉴定的与植物缺磷胁迫相关的转录因子中被定义为植物缺磷信号转导途径中的中心调控因子，许多下游受缺磷诱导表达的基因都受到其控制[1012]。但是通过正向遗传学克隆手段发现的PHR在转录水平对缺磷信号的响应相对其他响应并不是很明显，而是在翻译后水平被类泛素修饰E3 连接酶SIZ1调控[13]，因此通过常规的转录组表达谱的构建来筛选这类转录因子基因是一件相对困难的事情 [14]。数个参与到植物缺磷信号转导途径的转录因子被陆续报道，在PHR被报道之后， 其中双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻中是现在广泛报道并且正在进行深入研究的。这些转录因子包括OsMYB2P1、AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75和OsWRKY74等[1518] (Dai et al., 2012; Singh et al., 2014; Wang et al., 2014a, 2014b; Yang et al., 2014; Chen & Schmidt, 2015; Dai et al.,2016)。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1植物材料 3
1.2氨基酸序列对比分析 3
1.3水稻缺素处理3
1.4水稻DNA提取鉴定3
1.5水稻根部RNA抽提反转录反应以及半定量测定4
1.5.1 RNA抽提4
1.5.2 RNA反转录反应以及半定量测定4
1.6可溶性磷浓度测定4
1.6.1 试剂配制4
1.6.2 操作步骤4
1.6.3磷标准曲线的制作4
1.6.4 计算4
2结果5
2.1 OsWRKYP4的基因结构的分析5
2.2 WRKY家族进化树分析5
2.3OsWRKYP4亚细胞定位分析6
2.4OsWRKYP4对缺磷胁迫的响应6
2.5OsWRKYP4的CRISPR突变体材料的鉴定6
2.6OsWRKYP4突变体材料在不同磷水平下的表型分析及生理
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
数据测定7
3讨论9
致谢10
参考文献11
附录A RNA反转录反应以及cDNA合成12
图1.1WRKYP4基因结构5
图1.2 OsWRKYP4氨基酸序列5
图1.3进化树分析5
图1.4亚细胞定位6
图1.5A&B6
图1.6测序结果7
图1.7ABC8
图1.8ABC8
图1.9A&B9
水稻缺磷响应基因OsWRKYP4的突变体鉴定及其功能的初步验证
引言
引言
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，大米是全球板书以上人口的主食。我国水稻种植面积是世界上最多的，占世界水稻种植面积的20%，大米产量占我国粮食总产的44%，是保证我国粮食安全的最重要的作物。
在植物生长发育过程中磷是不可或缺的大量元素，同时也是许多生物大分子的重要组成部分[12]，在农田和自然生态系统中土壤中磷元素的缺乏是限制植物生长发育的关键因素之一。并且广泛参与植物体内各种生化合成、能量转移和信号转导等过程[3]。然而，由于磷容易固定和沉淀在土壤中，所以土壤溶液中磷的浓度一般情况只有110μM，因此在农田及自然生态系统中磷也常常成为植物生长的主要限制因子之一[3]。
综上所述，土壤中磷的生物有效性往往很低，而作物高产优质需要大量的磷，但我国所有
约80%的磷肥进入土壤与水系成为作物无效态磷，使土壤中的磷含量不断增加。过量的化肥投入，不但使我国成为世界上单位化肥投入增加最多、粮食产出最低的国家之一，并且直接导致化肥成本增加、水体富营养化、土壤酸化及磷矿等不可再生资源消耗加剧等一系列问题。据统计，在未来几十年内全球低成本的磷矿资源将被耗竭[45]
。因此，培育磷高效的高产优质作物品种，开发土壤磷库继而大幅度提高磷肥的利用效率具有重大的社会与经济意义，同时符合国家“化肥减量提效”这个需求。
在漫长的进化过程中植物已经形成了一套以适应缺磷环境的形态变化及生理生化改变，其中包括根系构型的改变、酸性磷酸酶及有机酸的分泌、与丛枝菌根真菌形成共生体系等等。所有这些机制都是由一些列复杂精巧的分子机制进行调控的[6]。而在最近几年，科学研究者们在该科学领域针对这些分子机制进行了了大量的科学研究，初步构建了植物缺磷信号转导途径的分子调控网络。虽然如此，多数科学研究主要集中在模式作物拟南芥身上，而水稻缺磷信号转导途径的分子调控网络更为复杂，所以仍可以对许多磷酸盐转运蛋白（PT）的上游转录因子进行探索研究。这些复杂的机制又是由一系列精巧的分子机制来调控的。迄今植物缺磷信号转导途径方面的研究已初步构建了该途径分子调控网络的轮廓。其中，转录因子起着关键性的调控作用[7]。
编码蛋白的基因的表达调控可以在多个水平进行，即转录水平，转录后水平，翻译水平及翻译后水平。所以不管是编码蛋白的基因还是非编码RNA等不编码蛋白的基因，转录水平的表达调控在基因功能及形态的进化过程中起着关键性作用[8]。转录因子调控基因的转录活性的方式是与下游基因启动子区域的cisacting element结合，。而转录因子编码的蛋白具有两个特征结构，即DNA结合结构域（DBD, DNABinding Domain）和转录活性的调控结构（RD, Regulatory Domain）。所以通过对转录因子不同特征的研究，它们被归类到不同的转录因子家族，如MYB，WRKY，bHLH、MADS，GRAS等。通过对下游靶基因的调控，这些转录因子在植物生长发育以及各种生物或非生物胁迫等过程中起着至关重要的作用。[9]
PHR (PhosphateStarvation Response) 在已鉴定的与植物缺磷胁迫相关的转录因子中被定义为植物缺磷信号转导途径中的中心调控因子，许多下游受缺磷诱导表达的基因都受到其控制[1012]。但是通过正向遗传学克隆手段发现的PHR在转录水平对缺磷信号的响应相对其他响应并不是很明显，而是在翻译后水平被类泛素修饰E3 连接酶SIZ1调控[13]，因此通过常规的转录组表达谱的构建来筛选这类转录因子基因是一件相对困难的事情 [14]。数个参与到植物缺磷信号转导途径的转录因子被陆续报道，在PHR被报道之后， 其中双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻中是现在广泛报道并且正在进行深入研究的。这些转录因子包括OsMYB2P1、AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75和OsWRKY74等[1518] (Dai et al., 2012; Singh et al., 2014; Wang et al., 2014a, 2014b; Yang et al., 2014; Chen & Schmidt, 2015; Dai et al.,2016)。
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