有机肥替代化肥对土壤微生物性质的影响
摘 要有机肥代替化肥的施用可以提升土壤品质，提高微生物的活性。采用田间试验，分别以秸秆，生物黑炭，猪粪，蚓粪与化肥配比施肥，研究不同有机肥和化肥的配施对江西红薯土壤中微生物的影响。结果表明与常规施肥相比，有机物施用促进了土壤中脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性的提升，其中猪粪和蚓粪处理达到显著水平；有机物的施用土壤基础呼吸、土壤微生物生物量碳、氮在有机物施用后均得到促进，其提升效果依次为蚓粪>猪粪>秸秆>生物黑炭。减量40%化肥配施猪粪和蚓粪显著增加了土壤细菌的Chao1和Shannon指数；与CF处理相比，施用有机物降低了Actinobacteria的相对丰度，秸秆和生物黑炭处理增加了Acidobacteria的相对丰度，猪粪和蚓粪处理降低了Acidobacteria和Chloroflexi的相对丰度，增加了Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度。关键字有机肥 土壤微生物 酶活性 相对丰度Effects of organic fertilizer instead of chemical fertilizer on soil microbial propertiesStudent majoring in environmental science Zhang huixinTutor Jiao jiaguoAbstract: organic fertilizer instead of chemical fertilizer can improve soil quality and improve microbial activity. Field experiments were carried out to fertilize the soil with straw, biological black charcoal, pig manure, vermis manure and fertilizer, and the effects of different organic manure and Fertilizer on the soil microorganism in the cultivated soil of Jiangxi sweet potato. The results show *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
ed that the application of organic matter promoted the activity of urease, acid protease, nitrate reductase and nitrous reductase in soil compared with conventional fertilization, and the treatment of pig manure and earthworm excrement reached a significant level, and soil basal respiration, soil microbial biomass carbon and nitrogen used after application of organic matter were all after application of organic matter. The promotion effect was followed by vermlet manure > pig manure > straw > biochar. The Chao1 and Shannon index of soil bacteria were significantly increased with the reduction of 40% fertilizer with pig manure and vermis. Compared with CF treatment, the relative abundance of Actinobacteria was reduced by using organic matter, and the relative abundance of Acidobacteria was increased by straw and biological black carbon treatment, and the treatment of pig manure and vermis was lower than that of Acidobacteria and Chloroflexi. Abundance increased the relative abundance of Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes.引言化肥在贫瘠土壤中的施用，有效的提升了土壤肥力，增大了土壤农作物的产量，但近些年在农地中，化肥的使用程度已经达到过度使用和地力透支的状态。我国农用地每公顷施用的化肥量平均从1980年的94.8 kg增加到2012年的480 kg，远远超过发达国家设定的225kg·hm-2的安全上限[1]。工业生产化肥，会消耗大量天然矿产资源，造成资源的严重浪费[2]，并且在使用化肥过程中，做不到因地制宜，适量而止，引起土壤理化性状恶化，加速土壤酸化，污染农田的生态环境[3~4]，不科学，不恰当的施用化肥将不利于改善土壤整体的生物性质［5］；也不利于农产品品质的提高，在很大程度上会浪费宝贵农业资金[6]。有机肥中的有机质含量较高的养分种类多、肥效时间较化肥更长，对于微生物群落结构和土壤自身的理化性质，有着很好的改良效果，并且可使地力长期维持，提升农产品的品质[7~8]。土壤微生物作为分解者，可将土壤中有机物分解成无机物，为农作物生长发育提供养分，是物质循环以及能量转化过程中不可获取的因素[9]。根据生物指示原理，土壤微生物所呈现出的理化性质[10]，生物量等可作为反映土壤有机质性质的指标，从而反映出该农地土壤的相关性质状况[11]。同时，大多数微生物可利用土壤中的有机碳（碳源），土壤氮的转化[12]，例如，根瘤菌固氮。有机肥本质上作为一种含碳物料，在施用有机肥的同时，是将碳源直接投入土壤的过程，从而土壤有机碳可以得到累积[13]。有机肥有很多种，由于其具有大量的有机质，可以起到很好的改土培肥作用，就单纯施用化肥相比，促进土壤微生物数量的增多的程度更深。但不同种类的有机肥对土壤微生物数量增长的促进作用存在着明显的差异[14]，并且施用有机肥也是将菌落接种土壤，直接提高土壤中微生物群落数量和种类[15]，指导了肥料在农田的实际使用中，可依据农田微生物的背景值和主导农作物生长的微生物种类，进行针对性选取施用，从而避免了效率低下的浪费。生物有机肥本身含有益菌群，对土壤微生物存在一定活化作用。土壤微生物作为分解者，具备分解有机质，提供养分的功能，其功能特点也是使得微生物能够作为土壤生态系统健康指示物的原因之一。在根际范围内，微生物的数量、pH值及氧化还原条件的变化、专性和非专性根系分泌物使植物根系产生对外界不良环境的适应性的反应，而且酶活性能够敏感响应土壤质量特别是土壤生物群落的变化，因此，根际效应反映出植物和土壤微生物之间密切影响的关系酶的专一性和多样性可以更全面地反映参与物质循环的土壤生物群落的功能特征对土壤酶活性的研究有利于我们对各种土壤参数的获得。一块农用地中长期单一施用化肥会降低单位微生物量氮酶活性，这表明长期单施化肥会导致土壤有机碳的限制，而单一施用有机肥可以缓解碳胁迫，但是有可能会限制农作物对氮素养分的吸收，有机肥和化肥的合理配施则可优势互补，提高土壤生态功能的发挥的持久性[16]。长期施用有机肥相比空白以及普通化肥使用，都更土壤SOC的含量提高，有机肥在促进生物群落结构改变过程中，使得土壤有机碳也得以增加，这样更加促进以分解有机碳的分解者含量的提高，有机肥不仅为植物生长提供了养分，也会直接或间接影响土壤肥力、pH值、温度、土壤质地等因素，促进土壤朝着利于微生物的环境条件发展，可以提升丰富度，进而影响土壤微生物的群落结构[17]。本文拟在通过研究有机物施用对土壤微生物的影响，验证有机物的施用对土壤培肥的重要意义，为有机物代替化肥的可行性提供有力的理论基础。1材料与方法1.1材料 种植制度红薯-油菜轮作 。试验地设在江西省红壤研究所，试验地布置于2015年5月，共设置9个处理，具体如下表1-1 处理编号处理名称 CK 不施肥 CF 100%NPK，（依据当地化肥施用量）RF 60%NPK（CF基础上减少40%）CFR 100%NPK+秸秆（300kg/亩） RFR 60%NPK+秸秆（300kg/亩） CFB 100%NPK+生物黑炭（100kg/亩） RFB 60%NPK+生物黑炭（100kg/亩） RFP 60%NPK+猪粪（1000kg/亩） RFV 60%NPK+蚓粪（1000kg/亩） 每个小区面积4m×7m=28m2，沟宽40cm；红薯种植密度50cm×40cm，每小区种植100株红薯（4次重复，36个小区）完全随机区组排列，秸秆、生物黑炭、猪粪、蚓粪在作物移栽前一次性施入，不追肥。田间灌溉、除草均由当地农民完成，不施农药。1.2试验设计在江西红薯季成熟期采样。土壤样品采用多点混合采样方法采集0-20cm土壤，将采回的土壤混匀后分三份，一部分装入自封袋置于4℃冰箱保存，用于测定土壤测定土壤微生物生物量碳、氮以及基础呼吸；一部分储存与-80℃冰箱，用于土壤微生物群落结构的测定；另外一部分土壤置于室内通风阴干，研磨供土壤理化指标测定分析。1.3测定指标及方法铵态氮、硝态氮2mol/L KCl浸提-流动分析仪测定。土壤全氮凯氏定氮法。土壤微生物生物量碳（MBC）和氮（MBN）的测定采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法，用K2CrO7外加热法测定滤液中MBC含量；采用半微量凯氏定氮法定MBN含量。土壤基础呼吸（BR）测定称取相当于10.0 g干土的新鲜土壤到100 mL盐水瓶中，黑暗室温条件培育24 h后通风4小时。密封后黑暗条件下，培养24 h。用10 mL注射器采集10 mL气体，采用气相色谱（AGILENT，USA）测定CO2浓度。土壤酶活性测定脲酶用靛酚蓝比色法测定，酸性蛋白酶（S-ACPT）、硝酸还原酶（S-NR）和亚硝酸还原酶（S-NIR）用分光光度法测定。土壤细菌微生物群落结构测定（1）DNA提取土壤DNA提取是根据手册使用动力土壤DNA分离试剂盒(Mobio Laboratories Carlsbad，CA)进行。完成提取后，利用1%份琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的纯度和浓度。（2）PCR扩增对细菌16S rRNA基因V3-V4高变区片段进行扩增，将纯化后的DNA作为模版，选用细菌通用引物357F（CTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增16S rDNAV3+V4区片段（Wollenberg et al., 2016）。每个土样的正向和反向引物的5’端加上10位条形码序列，PCR反应采用Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germany)，50μl反应体系10×Ex Taq Buffer (Mg2+ plus) 5μl， 12.5 mM dNTP Mix (每个) 4μl，1.25 U Ex Taq DNA聚合酶， DNA模板2μl，每个样品200 nM967F和1406R条形码引物及36.75μl ddH2O。循环参数为94℃预变性2min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min，10℃保存备用。每个样本聚合3个PCR产物，以减轻反应水平的PCR偏差，PCR产物用QIAGEN快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，用实时PCR定量，并在北京Auwigene公司进行测序。（3）高通量测序在北京奥维森公司的MISEQ平台上进行了深度测序，运行后，利用Illumina分析流水线2.6进行图像分析、调整和误差估计。（4）数据分析对原始数据进行筛选，删除序列小于200 bp、质量分数≤20、碱基含糊不清或与引物序列和条形码标签不完全匹配的数据。经示例特定的条形码序列分离的，并使用Illumina分析流水线2.6进行修整的数据为合格数据，然后利用QIIME对数据集进行分析。这些序列在97%的相似性水平下被聚为操作分类单元（OTUs），以生成稀疏曲线，并计算丰富度和多样性指数。利用核糖体数据库项目(RDP)分类工具将所有序列分类为不同的分类群。运用R语言检验不同样本之间的相似性，采用聚类分析和主成分分析(PCA)方法，对每个样本进行聚类分析和主成分分析。1.4 数据统计分析实验数据利用Microsoft Excel 2013 、SPSS22.0软件进行统计分析，用Microsoft Excel 2013、R语言进行图表制作，采用Duncan检验法（p<0.05）进行显著性分析，相关性分析采样Pearson双侧显著检验。2结果分析2.1有机肥替代对红壤酶活性的影响土壤酶活性可反映土壤肥力水平。土壤脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶均会参与到氮素循环转化，是将土壤中难吸收的氮转化为易吸收矿质态氮的关键酶，在土壤氮循环中起重要作用。由表1-1可知，施用有机物均能够提高土壤脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的活性，其中RFP和RFV处理的提升效果最佳。与CF处理相比，配施有机物后土壤脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性均得到一定提升，其中减量40%化肥配施猪粪和蚓粪达到显著水平，分别提升44.94%、56.33%、116.60%、82.48%和47.18%、46.84%、148.18%、75.25%。整体而言，有机物的施用提高了土壤酶活性，促进了土壤中氮素转化，进而提高了土壤中氮素含量。表2-1不同有机物施用对红壤酶活性的影响Tab. 2-1 Effects of different organic materials on enzyme activities in red soil处理脲酶(UE, μg/d/g)酸性蛋白酶(ACPT, mg/d/g)硝酸还原酶(NR, μmol/d/g)亚硝酸还原酶(NIR, μmol/d/g)CK329.96±24.94c1.14±0.18d8.30±0.18e15.77±1.05cCF359.36±22.30bc1.58±0.16bcd12.89±1.07d16.04±0.64bRF344.59±9.45bc1.44±0.15cd12.35±0.73d16.39±1.09bcCFR407.25±21.21b2.05±0.30abc16.86±0.66c19.39±2.23bcRFR408.39±22.63b2.38±0.40ab19.10±0.85c19,66±1.16bcCFB410.96±26.42b1.94±0.28abcd19.81±1.15c20.26±1.56baRFB400.79±26.53b2.14±0.32abc19.27±1.52c20.64±1.15bRFP520.87±12.08a2.47±0.17a27.92±1.53b29.27±1.74aRFV528.89±8.19a2.32±0.30ab31.99±2.15a28.11±1.22a2.2有机肥替代对红壤微生物呼吸及微生物生物量碳氮的影响不同施肥处理的土壤基础呼吸强度变化如图1-1。有机物的施用均提高了土壤基础呼吸。相比于CF处理，配施有机物后土壤基础呼吸强度均得到提升，增幅为28.57%~314.29%，其中猪粪和蚓粪效果最为显著（P<0.05）。施肥会对土壤微生物产生显著影响，有机肥的施用会对土壤微生物数量产生直接的影响，而化肥则通过改变土壤养分元素和pH对土壤微生物数量产生影响。不同施肥处理对土壤微生物生物量碳、氮的影响见图1-2。与CF处理相比，猪粪和蚓粪的施用增加了土壤微生物生物量碳、氮；秸秆和生物黑炭的施用促进了土壤微生物生物量碳、氮的提升，其中MBC较CF处理达到显著水平。整体而言，有机物的施用能够提高土壤基础呼吸强度和微生物生物量碳、氮，猪粪和蚓粪的效果最为显著，秸秆次之，生物黑炭的效果最低。图2-1不同有机物施用对红壤土壤呼吸的影响Fig. 2-1 Effects of different organic materials on soil respiration in red soil.图2-2不同有机物施用对红壤微生物生物量碳氮的影响（A:微生物生物量碳；B:微生物生物量氮）Fig. 2-2 effects of different organic compounds on microbial biomass carbon and nitrogen in red soil.2.3有机肥替代对微生物多样性的影响土壤微生物多样性代表着微生物群落的稳定性，对于探索促进土壤可持续利用及土壤微生物种质资源的开发和利用有重要意义。根据OUT的菌种，计算样本的Alpha多样性，如图1-3所示。Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，经常用物种丰富度来度量，包括Chao1值和Shannon指数等。Chao1指数是多样性的估算指数，代表菌种丰富度。与全量化肥（CF）处理相比，全量化肥配施生物黑炭处理（CFB）、减量40%化肥配施秸秆（RFR）、生物黑炭（RFB）、猪粪（RFP）和蚓粪（RFV）处理土壤细菌丰富度指数Chao1均得到提高，其中RFP和RFV处理达到显著水平。说明有机物的施用增加了土壤中细菌丰富度和细菌数量。Shannon指数代表菌群多样性，Shannon指数越大，表示菌群多样性越高。不同施肥处理土壤样本多样性指数差异较大，与CF处理相比，秸秆和生物黑炭降低了土壤Shannon指数， RFP和RFV两个处理的土壤Shannon指数显著增加。图2-3 不同有机物施用下红壤细菌物种多样性指数变化Fig. 2-3 Diversity indices of bacterial species in red soil under the application of different organic materials.2.4有机肥替代对细菌相对丰度的影响不同施肥处理对土壤细菌的群落结构和相对丰度上有较大影响。与CF处理相比，施用秸秆的处理（CFR和RFR）增加了土壤中Proteobacteria、Acidobacteria、Saccharibacteria、Cyanobacteria和Verrucomicrobia ，降低了土壤中Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes和Planctomycetes；施用生物黑炭的处理（CFB和RFB）土壤中Actinobacteria和Gemmatimonadetes分别增加了3.51%、0.86%和4.47%、2.48%，降低了土壤中Acidobacteria、Firmicutes、Planctomycetes、Saccharibacteria和Verrucomicrobia；RFP和RFV处理土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes分别增加了22.07%、7.67%和17.16%、5.18%，土壤中Chloroflexi、Acidobacteria、Actinobacteria和Planctomycetes分别降低13.15%、12.01%、3.56%、0.76%和10.98%、9.97%、0.94%、0.45%。图2-4 不同有机物施用下各处理样本中细菌基于门水平下的不同种群群落结构相对丰度Fig. 2-4 Relative abundances of different microbial community structures at the phylum level in different samples under different organic materials. As shown in the legend, different colors were used to represent the top 11 phyla (relative abundance >1%) most abundant phyla.3 讨论土壤酶活性能够反映土壤中各种生物化学反应过程的强度，它们与微生物活动密切相关[18]。Demisie等人研究表明[19] ~[22]生物质（生物黑炭、秸秆）配施化肥显著提高了土壤脲酶活性。本研究中，化肥配不同有机物料能够增加土壤中脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的活性，而施用猪粪和蚓粪可达到显著水平（P<0.05）。这可能是因为秸秆和生物黑炭本身氮含量较低[23]，在其缓慢腐解释放氮素之后，增加了土壤氮素含量，促进土壤氮素的转化，从而提高土壤脲酶活性；而猪粪和蚓粪本身氮含量较高，对土壤脲酶活性促进效果更为明显。袁玲等[24]研究表明，在施用化肥的基础上添加有机物料之后蛋白酶的底物浓度增加，从而提高了土壤蛋白酶的活性。本研究结果显示，有机物的施用提高了土壤基础呼吸强度，而猪粪和蚓粪的提升效果最佳。这主要是因为有机物的施用增加了土壤中腐殖物质，为土壤呼吸提供了充足的底物，促进了土壤微生物的生命活动代谢和生长繁殖[25]~ [26]。有机物特别是猪粪和蚓粪对土壤有机质和土壤氮素含量有显著增加作用，而土壤中氮含量的增加会促进土壤微生物的生命活动代谢，提高土壤有机质的分解速率[27]，从而进一步促进土壤呼吸速率增加。本研究表明，不论是全量化肥还是减量化肥，配施有机物后土壤微生物生物量碳、氮均有所提高，而施用猪粪和蚓粪的效果最为显著。这主要是因为有机物为土壤微生物提供了外来碳源，改善了土壤理化环境，而粪肥本身也含有大量的微生物，在施用的同时会将携带的大量碳源与微生物带进土壤中；同时有机物的施用会促进作物生物量的增加[28]。本试验中，有机物的施用提高了土壤细菌Chao1和Shannon多样性指数，尤其是猪粪和蚓粪显著增加了细菌菌群多样性指数。Tian Wei等[29]研究表明，猪粪有机无机复合肥能够增加土壤养分含量和微生物功能多样性；Zhao Shicheng[30]Li Juan[31]等人的研究同样指出，秸秆还田、有机肥替代部分化肥均能提高土壤养分含量，促进土壤微生物功能多样性的增加。这是因为有机肥的施用，特别是猪粪和蚓粪这一类新鲜有机物会向土壤引入大量的微生物种类，也会带入充足的碳源，促进土壤中微生物的繁殖生长，进而增加土壤微生物物种多样性[32]。本试验中，各处理优势门类群（平均相对丰度>10%）为Proteobacteria（变形菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）和Actinobacteria（放线菌门），Liu等（2014）和孙瑞波等[33]的农田研究土壤中也得到了相似的结果。Liu P等[34]的研究表明，在粪肥施用下，土壤中的Actinobacteria、Proteobacteria相对丰度增加。这可能是因为有机物的施用增加了土壤有机碳含量，增加土壤碳源，而有机碳的增加会促进土壤中的Proteobacteria中的部分类群的数量的改变，进而改变变形菌的菌群相对丰度[35]。4 结论（1）与常规施肥相比，有机物施用促进了土壤中脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性的提升，其中猪粪和蚓粪处理达到显著水平；土壤基础呼吸、土壤微生物生物量碳、氮在有机物施用后均得到促进，其提升效果依次为蚓粪>猪粪>秸秆>生物黑炭。（2）减量40%化肥配施猪粪和蚓粪显著增加了土壤细菌的Chao1和Shannon指数；与CF处理相比，施用有机物降低了Actinobacteria的相对丰度，秸秆和生物黑炭处理增加了Acidobacteria的相对丰度，猪粪和蚓粪处理降低了Acidobacteria和Chloroflexi的相对丰度，增加了Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度。致谢此外，我也得到了邬梦成和李鹏师兄在实验中手把手的指导，文献阅读过程中细节问题的讲解以及论文写作过程中的疑惑解答，提升我的实验操作能力，阅读文献能力和学术论文的写作能力。对他们这种无私耐心的奉献和帮助表示诚挚的感谢。参考文献宁川川,王建武,蔡昆争.有机肥对土壤肥力和土壤环境质量的影响研究进展[J].生态环境学报,2016,25(01):175-181. 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目录
摘 要 1
关键字： 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2试验设计 3
1.3测定指标及方法 3
1.4 数据统计分析 4
2结果分析 4
2.1有机肥替代对红壤酶活性的影响 4
2.2有机肥替代对红壤微生物呼吸及微生物生物量碳氮的影响 4
2.3有机肥替代对微生物多样性的影响 6
2.4有机肥替代对细菌相对丰度的影响 7
3 讨论 7
4 结论 8
致谢 8
参考文献 8
不同有机肥替代化肥对土壤微生物性质的影响
引言
ed that the application of organic matter promoted the activity of urease, acid protease, nitrate reductase and nitrous reductase in soil compared with conventional fertilization, and the treatment of pig manure and earthworm excrement reached a significant level, and soil basal respiration, soil microbial biomass carbon and nitrogen used after application of organic matter were all after application of organic matter. The promotion effect was followed by vermlet manure > pig manure > straw > biochar. The Chao1 and Shannon index of soil bacteria were significantly increased with the reduction of 40% fertilizer with pig manure and vermis. Compared with CF treatment, the relative abundance of Actinobacteria was reduced by using organic matter, and the relative abundance of Acidobacteria was increased by straw and biological black carbon treatment, and the treatment of pig manure and vermis was lower than that of Acidobacteria and Chloroflexi. Abundance increased the relative abundance of Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes.引言化肥在贫瘠土壤中的施用，有效的提升了土壤肥力，增大了土壤农作物的产量，但近些年在农地中，化肥的使用程度已经达到过度使用和地力透支的状态。我国农用地每公顷施用的化肥量平均从1980年的94.8 kg增加到2012年的480 kg，远远超过发达国家设定的225kg·hm-2的安全上限[1]。工业生产化肥，会消耗大量天然矿产资源，造成资源的严重浪费[2]，并且在使用化肥过程中，做不到因地制宜，适量而止，引起土壤理化性状恶化，加速土壤酸化，污染农田的生态环境[3~4]，不科学，不恰当的施用化肥将不利于改善土壤整体的生物性质［5］；也不利于农产品品质的提高，在很大程度上会浪费宝贵农业资金[6]。有机肥中的有机质含量较高的养分种类多、肥效时间较化肥更长，对于微生物群落结构和土壤自身的理化性质，有着很好的改良效果，并且可使地力长期维持，提升农产品的品质[7~8]。土壤微生物作为分解者，可将土壤中有机物分解成无机物，为农作物生长发育提供养分，是物质循环以及能量转化过程中不可获取的因素[9]。根据生物指示原理，土壤微生物所呈现出的理化性质[10]，生物量等可作为反映土壤有机质性质的指标，从而反映出该农地土壤的相关性质状况[11]。同时，大多数微生物可利用土壤中的有机碳（碳源），土壤氮的转化[12]，例如，根瘤菌固氮。有机肥本质上作为一种含碳物料，在施用有机肥的同时，是将碳源直接投入土壤的过程，从而土壤有机碳可以得到累积[13]。有机肥有很多种，由于其具有大量的有机质，可以起到很好的改土培肥作用，就单纯施用化肥相比，促进土壤微生物数量的增多的程度更深。但不同种类的有机肥对土壤微生物数量增长的促进作用存在着明显的差异[14]，并且施用有机肥也是将菌落接种土壤，直接提高土壤中微生物群落数量和种类[15]，指导了肥料在农田的实际使用中，可依据农田微生物的背景值和主导农作物生长的微生物种类，进行针对性选取施用，从而避免了效率低下的浪费。生物有机肥本身含有益菌群，对土壤微生物存在一定活化作用。土壤微生物作为分解者，具备分解有机质，提供养分的功能，其功能特点也是使得微生物能够作为土壤生态系统健康指示物的原因之一。在根际范围内，微生物的数量、pH值及氧化还原条件的变化、专性和非专性根系分泌物使植物根系产生对外界不良环境的适应性的反应，而且酶活性能够敏感响应土壤质量特别是土壤生物群落的变化，因此，根际效应反映出植物和土壤微生物之间密切影响的关系酶的专一性和多样性可以更全面地反映参与物质循环的土壤生物群落的功能特征对土壤酶活性的研究有利于我们对各种土壤参数的获得。一块农用地中长期单一施用化肥会降低单位微生物量氮酶活性，这表明长期单施化肥会导致土壤有机碳的限制，而单一施用有机肥可以缓解碳胁迫，但是有可能会限制农作物对氮素养分的吸收，有机肥和化肥的合理配施则可优势互补，提高土壤生态功能的发挥的持久性[16]。长期施用有机肥相比空白以及普通化肥使用，都更土壤SOC的含量提高，有机肥在促进生物群落结构改变过程中，使得土壤有机碳也得以增加，这样更加促进以分解有机碳的分解者含量的提高，有机肥不仅为植物生长提供了养分，也会直接或间接影响土壤肥力、pH值、温度、土壤质地等因素，促进土壤朝着利于微生物的环境条件发展，可以提升丰富度，进而影响土壤微生物的群落结构[17]。本文拟在通过研究有机物施用对土壤微生物的影响，验证有机物的施用对土壤培肥的重要意义，为有机物代替化肥的可行性提供有力的理论基础。1材料与方法1.1材料 种植制度红薯-油菜轮作 。试验地设在江西省红壤研究所，试验地布置于2015年5月，共设置9个处理，具体如下表1-1 处理编号处理名称 CK 不施肥 CF 100%NPK，（依据当地化肥施用量）RF 60%NPK（CF基础上减少40%）CFR 100%NPK+秸秆（300kg/亩） RFR 60%NPK+秸秆（300kg/亩） CFB 100%NPK+生物黑炭（100kg/亩） RFB 60%NPK+生物黑炭（100kg/亩） RFP 60%NPK+猪粪（1000kg/亩） RFV 60%NPK+蚓粪（1000kg/亩） 每个小区面积4m×7m=28m2，沟宽40cm；红薯种植密度50cm×40cm，每小区种植100株红薯（4次重复，36个小区）完全随机区组排列，秸秆、生物黑炭、猪粪、蚓粪在作物移栽前一次性施入，不追肥。田间灌溉、除草均由当地农民完成，不施农药。1.2试验设计在江西红薯季成熟期采样。土壤样品采用多点混合采样方法采集0-20cm土壤，将采回的土壤混匀后分三份，一部分装入自封袋置于4℃冰箱保存，用于测定土壤测定土壤微生物生物量碳、氮以及基础呼吸；一部分储存与-80℃冰箱，用于土壤微生物群落结构的测定；另外一部分土壤置于室内通风阴干，研磨供土壤理化指标测定分析。1.3测定指标及方法铵态氮、硝态氮2mol/L KCl浸提-流动分析仪测定。土壤全氮凯氏定氮法。土壤微生物生物量碳（MBC）和氮（MBN）的测定采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法，用K2CrO7外加热法测定滤液中MBC含量；采用半微量凯氏定氮法定MBN含量。土壤基础呼吸（BR）测定称取相当于10.0 g干土的新鲜土壤到100 mL盐水瓶中，黑暗室温条件培育24 h后通风4小时。密封后黑暗条件下，培养24 h。用10 mL注射器采集10 mL气体，采用气相色谱（AGILENT，USA）测定CO2浓度。土壤酶活性测定脲酶用靛酚蓝比色法测定，酸性蛋白酶（S-ACPT）、硝酸还原酶（S-NR）和亚硝酸还原酶（S-NIR）用分光光度法测定。土壤细菌微生物群落结构测定（1）DNA提取土壤DNA提取是根据手册使用动力土壤DNA分离试剂盒(Mobio Laboratories Carlsbad，CA)进行。完成提取后，利用1%份琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的纯度和浓度。（2）PCR扩增对细菌16S rRNA基因V3-V4高变区片段进行扩增，将纯化后的DNA作为模版，选用细菌通用引物357F（CTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增16S rDNAV3+V4区片段（Wollenberg et al., 2016）。每个土样的正向和反向引物的5’端加上10位条形码序列，PCR反应采用Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germany)，50μl反应体系10×Ex Taq Buffer (Mg2+ plus) 5μl， 12.5 mM dNTP Mix (每个) 4μl，1.25 U Ex Taq DNA聚合酶， DNA模板2μl，每个样品200 nM967F和1406R条形码引物及36.75μl ddH2O。循环参数为94℃预变性2min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min，10℃保存备用。每个样本聚合3个PCR产物，以减轻反应水平的PCR偏差，PCR产物用QIAGEN快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，用实时PCR定量，并在北京Auwigene公司进行测序。（3）高通量测序在北京奥维森公司的MISEQ平台上进行了深度测序，运行后，利用Illumina分析流水线2.6进行图像分析、调整和误差估计。（4）数据分析对原始数据进行筛选，删除序列小于200 bp、质量分数≤20、碱基含糊不清或与引物序列和条形码标签不完全匹配的数据。经示例特定的条形码序列分离的，并使用Illumina分析流水线2.6进行修整的数据为合格数据，然后利用QIIME对数据集进行分析。这些序列在97%的相似性水平下被聚为操作分类单元（OTUs），以生成稀疏曲线，并计算丰富度和多样性指数。利用核糖体数据库项目(RDP)分类工具将所有序列分类为不同的分类群。运用R语言检验不同样本之间的相似性，采用聚类分析和主成分分析(PCA)方法，对每个样本进行聚类分析和主成分分析。1.4 数据统计分析实验数据利用Microsoft Excel 2013 、SPSS22.0软件进行统计分析，用Microsoft Excel 2013、R语言进行图表制作，采用Duncan检验法（p<0.05）进行显著性分析，相关性分析采样Pearson双侧显著检验。2结果分析2.1有机肥替代对红壤酶活性的影响土壤酶活性可反映土壤肥力水平。土壤脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶均会参与到氮素循环转化，是将土壤中难吸收的氮转化为易吸收矿质态氮的关键酶，在土壤氮循环中起重要作用。由表1-1可知，施用有机物均能够提高土壤脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的活性，其中RFP和RFV处理的提升效果最佳。与CF处理相比，配施有机物后土壤脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性均得到一定提升，其中减量40%化肥配施猪粪和蚓粪达到显著水平，分别提升44.94%、56.33%、116.60%、82.48%和47.18%、46.84%、148.18%、75.25%。整体而言，有机物的施用提高了土壤酶活性，促进了土壤中氮素转化，进而提高了土壤中氮素含量。表2-1不同有机物施用对红壤酶活性的影响Tab. 2-1 Effects of different organic materials on enzyme activities in red soil处理脲酶(UE, μg/d/g)酸性蛋白酶(ACPT, mg/d/g)硝酸还原酶(NR, μmol/d/g)亚硝酸还原酶(NIR, μmol/d/g)CK329.96±24.94c1.14±0.18d8.30±0.18e15.77±1.05cCF359.36±22.30bc1.58±0.16bcd12.89±1.07d16.04±0.64bRF344.59±9.45bc1.44±0.15cd12.35±0.73d16.39±1.09bcCFR407.25±21.21b2.05±0.30abc16.86±0.66c19.39±2.23bcRFR408.39±22.63b2.38±0.40ab19.10±0.85c19,66±1.16bcCFB410.96±26.42b1.94±0.28abcd19.81±1.15c20.26±1.56baRFB400.79±26.53b2.14±0.32abc19.27±1.52c20.64±1.15bRFP520.87±12.08a2.47±0.17a27.92±1.53b29.27±1.74aRFV528.89±8.19a2.32±0.30ab31.99±2.15a28.11±1.22a2.2有机肥替代对红壤微生物呼吸及微生物生物量碳氮的影响不同施肥处理的土壤基础呼吸强度变化如图1-1。有机物的施用均提高了土壤基础呼吸。相比于CF处理，配施有机物后土壤基础呼吸强度均得到提升，增幅为28.57%~314.29%，其中猪粪和蚓粪效果最为显著（P<0.05）。施肥会对土壤微生物产生显著影响，有机肥的施用会对土壤微生物数量产生直接的影响，而化肥则通过改变土壤养分元素和pH对土壤微生物数量产生影响。不同施肥处理对土壤微生物生物量碳、氮的影响见图1-2。与CF处理相比，猪粪和蚓粪的施用增加了土壤微生物生物量碳、氮；秸秆和生物黑炭的施用促进了土壤微生物生物量碳、氮的提升，其中MBC较CF处理达到显著水平。整体而言，有机物的施用能够提高土壤基础呼吸强度和微生物生物量碳、氮，猪粪和蚓粪的效果最为显著，秸秆次之，生物黑炭的效果最低。图2-1不同有机物施用对红壤土壤呼吸的影响Fig. 2-1 Effects of different organic materials on soil respiration in red soil.图2-2不同有机物施用对红壤微生物生物量碳氮的影响（A:微生物生物量碳；B:微生物生物量氮）Fig. 2-2 effects of different organic compounds on microbial biomass carbon and nitrogen in red soil.2.3有机肥替代对微生物多样性的影响土壤微生物多样性代表着微生物群落的稳定性，对于探索促进土壤可持续利用及土壤微生物种质资源的开发和利用有重要意义。根据OUT的菌种，计算样本的Alpha多样性，如图1-3所示。Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，经常用物种丰富度来度量，包括Chao1值和Shannon指数等。Chao1指数是多样性的估算指数，代表菌种丰富度。与全量化肥（CF）处理相比，全量化肥配施生物黑炭处理（CFB）、减量40%化肥配施秸秆（RFR）、生物黑炭（RFB）、猪粪（RFP）和蚓粪（RFV）处理土壤细菌丰富度指数Chao1均得到提高，其中RFP和RFV处理达到显著水平。说明有机物的施用增加了土壤中细菌丰富度和细菌数量。Shannon指数代表菌群多样性，Shannon指数越大，表示菌群多样性越高。不同施肥处理土壤样本多样性指数差异较大，与CF处理相比，秸秆和生物黑炭降低了土壤Shannon指数， RFP和RFV两个处理的土壤Shannon指数显著增加。图2-3 不同有机物施用下红壤细菌物种多样性指数变化Fig. 2-3 Diversity indices of bacterial species in red soil under the application of different organic materials.2.4有机肥替代对细菌相对丰度的影响不同施肥处理对土壤细菌的群落结构和相对丰度上有较大影响。与CF处理相比，施用秸秆的处理（CFR和RFR）增加了土壤中Proteobacteria、Acidobacteria、Saccharibacteria、Cyanobacteria和Verrucomicrobia ，降低了土壤中Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes和Planctomycetes；施用生物黑炭的处理（CFB和RFB）土壤中Actinobacteria和Gemmatimonadetes分别增加了3.51%、0.86%和4.47%、2.48%，降低了土壤中Acidobacteria、Firmicutes、Planctomycetes、Saccharibacteria和Verrucomicrobia；RFP和RFV处理土壤中Proteobacteria和Bacteroidetes分别增加了22.07%、7.67%和17.16%、5.18%，土壤中Chloroflexi、Acidobacteria、Actinobacteria和Planctomycetes分别降低13.15%、12.01%、3.56%、0.76%和10.98%、9.97%、0.94%、0.45%。图2-4 不同有机物施用下各处理样本中细菌基于门水平下的不同种群群落结构相对丰度Fig. 2-4 Relative abundances of different microbial community structures at the phylum level in different samples under different organic materials. As shown in the legend, different colors were used to represent the top 11 phyla (relative abundance >1%) most abundant phyla.3 讨论土壤酶活性能够反映土壤中各种生物化学反应过程的强度，它们与微生物活动密切相关[18]。Demisie等人研究表明[19] ~[22]生物质（生物黑炭、秸秆）配施化肥显著提高了土壤脲酶活性。本研究中，化肥配不同有机物料能够增加土壤中脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的活性，而施用猪粪和蚓粪可达到显著水平（P<0.05）。这可能是因为秸秆和生物黑炭本身氮含量较低[23]，在其缓慢腐解释放氮素之后，增加了土壤氮素含量，促进土壤氮素的转化，从而提高土壤脲酶活性；而猪粪和蚓粪本身氮含量较高，对土壤脲酶活性促进效果更为明显。袁玲等[24]研究表明，在施用化肥的基础上添加有机物料之后蛋白酶的底物浓度增加，从而提高了土壤蛋白酶的活性。本研究结果显示，有机物的施用提高了土壤基础呼吸强度，而猪粪和蚓粪的提升效果最佳。这主要是因为有机物的施用增加了土壤中腐殖物质，为土壤呼吸提供了充足的底物，促进了土壤微生物的生命活动代谢和生长繁殖[25]~ [26]。有机物特别是猪粪和蚓粪对土壤有机质和土壤氮素含量有显著增加作用，而土壤中氮含量的增加会促进土壤微生物的生命活动代谢，提高土壤有机质的分解速率[27]，从而进一步促进土壤呼吸速率增加。本研究表明，不论是全量化肥还是减量化肥，配施有机物后土壤微生物生物量碳、氮均有所提高，而施用猪粪和蚓粪的效果最为显著。这主要是因为有机物为土壤微生物提供了外来碳源，改善了土壤理化环境，而粪肥本身也含有大量的微生物，在施用的同时会将携带的大量碳源与微生物带进土壤中；同时有机物的施用会促进作物生物量的增加[28]。本试验中，有机物的施用提高了土壤细菌Chao1和Shannon多样性指数，尤其是猪粪和蚓粪显著增加了细菌菌群多样性指数。Tian Wei等[29]研究表明，猪粪有机无机复合肥能够增加土壤养分含量和微生物功能多样性；Zhao Shicheng[30]Li Juan[31]等人的研究同样指出，秸秆还田、有机肥替代部分化肥均能提高土壤养分含量，促进土壤微生物功能多样性的增加。这是因为有机肥的施用，特别是猪粪和蚓粪这一类新鲜有机物会向土壤引入大量的微生物种类，也会带入充足的碳源，促进土壤中微生物的繁殖生长，进而增加土壤微生物物种多样性[32]。本试验中，各处理优势门类群（平均相对丰度>10%）为Proteobacteria（变形菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）和Actinobacteria（放线菌门），Liu等（2014）和孙瑞波等[33]的农田研究土壤中也得到了相似的结果。Liu P等[34]的研究表明，在粪肥施用下，土壤中的Actinobacteria、Proteobacteria相对丰度增加。这可能是因为有机物的施用增加了土壤有机碳含量，增加土壤碳源，而有机碳的增加会促进土壤中的Proteobacteria中的部分类群的数量的改变，进而改变变形菌的菌群相对丰度[35]。4 结论（1）与常规施肥相比，有机物施用促进了土壤中脲酶、酸性蛋白酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性的提升，其中猪粪和蚓粪处理达到显著水平；土壤基础呼吸、土壤微生物生物量碳、氮在有机物施用后均得到促进，其提升效果依次为蚓粪>猪粪>秸秆>生物黑炭。（2）减量40%化肥配施猪粪和蚓粪显著增加了土壤细菌的Chao1和Shannon指数；与CF处理相比，施用有机物降低了Actinobacteria的相对丰度，秸秆和生物黑炭处理增加了Acidobacteria的相对丰度，猪粪和蚓粪处理降低了Acidobacteria和Chloroflexi的相对丰度，增加了Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度。致谢此外，我也得到了邬梦成和李鹏师兄在实验中手把手的指导，文献阅读过程中细节问题的讲解以及论文写作过程中的疑惑解答，提升我的实验操作能力，阅读文献能力和学术论文的写作能力。对他们这种无私耐心的奉献和帮助表示诚挚的感谢。参考文献宁川川,王建武,蔡昆争.有机肥对土壤肥力和土壤环境质量的影响研究进展[J].生态环境学报,2016,25(01):175-181. M.ROELCKE，KHSCHLEEF，J.RICHTER.Recent Trends and Recommendations for Nitrogen Fertilization in Intensive Agriculture in China China [J]。植物圈，2004（04）449-460。R. Dinesh,V. Srinivasan,S. Hamza,A. Manjusha. Short-term incorporation of organic manures and biofertilizers influences biochemical and microbial characteristics of soils under an annual crop [Turmeric ( Curcuma longa L.)][J]. Bioresource Technology,2010,101(12). Guo J H,Liu X J,Zhang Y,Shen J L,Han W X,Zhang W F,Christie P,Goulding K W T,Vitousek P M,Zhang F S. Significant acidification in major Chinese croplands.[J]. Science,2010,327(5968). Kate Bradley,Rhae A. Drijber,Jean Knops. Increased N availability in grassland soils modifies their microbial communities and decreases the abundance of arbuscular mycorrhizal fungi[J]. 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目录
摘 要 1
关键字： 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.2试验设计 3
1.3测定指标及方法 3
1.4 数据统计分析 4
2结果分析 4
2.1有机肥替代对红壤酶活性的影响 4
2.2有机肥替代对红壤微生物呼吸及微生物生物量碳氮的影响 4
2.3有机肥替代对微生物多样性的影响 6
2.4有机肥替代对细菌相对丰度的影响 7
3 讨论 7
4 结论 8
致谢 8
参考文献 8
不同有机肥替代化肥对土壤微生物性质的影响
引言
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