盐藻对亚砷酸盐的吸收和代谢的研究
摘要：此课题为盐藻对亚砷酸盐的吸收和代谢的研究。砷（As）是广泛存在于自然界的一种公认的剧毒类金属，并对人类健康产生威胁[1-2]。本次实验共培养盐藻九天，探究了在正常P和十分之一P两种培养条件下，盐藻对亚砷酸盐的吸附以及富集作用。实验数据表明亚砷酸盐明显抑制了盐藻的生长，在十分之一P条件下处理的盐藻对亚砷酸盐的吸附作用更强。在第七天时盐藻胞内的砷浓度达到最大值，即盐藻对亚砷酸盐的吸收和富集存在着上限。通过分析盐藻内砷的形态表明盐藻对砷的解毒机制主要是将毒性较大的三价砷转化为毒性较小的五价砷。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法1
1.1 藻种与培养条件 1
1.2 实验设计 2
1.3 测定项目与方法 2
1.3.1 处理方法2
1.3.2 盐藻OD值测定2
1.3.3盐藻吸收As和富集As的测定2
1.3.4盐藻内As形态测定2
2 结果与分析2
2.1不同P条件下盐藻细胞生长情况3
2.2盐藻对As的吸收富集测定3
2.3上清液中总As的测定3
2.4盐藻中As形态的测定4
3 讨论 4
致谢5
参考文献5
盐藻对亚砷酸盐的吸收和代谢的研究
引言
引言
对于生物来说，砷是非生命所需元素，为适应环境中的砷，生物在长期的进化过程中发展出一系列的砷解毒机制，以降低砷对其自身的毒害。目前关于砷氧化的研究正在逐步深入，自从第一株As(III)氧化菌在1918年首次被报道[3]，随着研究的发展，越来越多的As(III)氧化菌被发现。汪耀和王革娇等在2010年鉴定出一株新型亚砷酸氧化菌Sinorhizobium sp．GW3，直到现在，王革娇所在的实验室已从我国不同砷污染源分离鉴定出近20种As(III)氧化菌[4]。
随着工业的发展，人为因素导致的海洋砷污染已成为广泛存在的问题。有些海洋藻类对砷的吸收能力很强，胞内的砷含量可以达到海水中砷含量
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
的几个数量级，因此海洋微藻对砷的吸收富集以及转化即成为研究热点。海洋微藻中，由于盐藻的生存条件最宽泛，所以盐藻的分布范围也相当广泛，且砷具有较强的砷富集能力，这些条件使得利用盐藻作为修复砷污染水体的生物修复剂成为可能。本实验即旨在探讨盐藻对亚砷酸盐的吸收与富集。盐藻在利用硝酸盐和磷酸盐的同时，由于氮、磷、砷为同组元素，可能盐藻会通过吸收磷酸盐、硝酸盐的途径来吸收砷酸盐、亚砷酸盐，这可能是盐藻能大量吸收富集海水砷的机制。
本次实验设置了正常P和十分之一P两个不同的培养背景，一共经过九天的培养。收集并处理藻样，每隔两天测定其OD值，测定盐藻胞内吸收的砷含量以及富集在表面的砷含量，上清液中的砷浓度，以及胞内砷的形态测定。
1 材料与方法
1．1 藻种与培养条件
盐藻购自山东青岛中国科学院海洋生物种质库。盐藻的培养需使用f/2培养基[5]，ph调至7.5，并高压蒸汽灭菌(121℃灭菌30min)，盐藻的初始细胞密度为5×104cellmL–1?。培养基盐度为65、光照条件为12 h 光照、12 h黑暗(光强3000lx)、温度白天30℃、晚上25℃、培养时间为9 d。
1．2 实验设计
共设置四组，第一组为1/10含量P即0.112mg/L不加As、第二组为正常含量P即1.12mg/L不加As、第三组为1/10含量P加As（Ⅲ）112μg/L、第四组为正常含量P加As（Ⅲ）112μg/L。共培养9天。并设置两个空白对照（不加砷），每隔浓度设置三个平行试验。每隔两天测定其OD值、盐藻吸收和富集的砷含量、上清液中的砷含量，胞内砷形态并根据数据分析其解毒机制。
1．3 测定项目与方法
1．3．1 处理方法
用高速冷冻离心机（Beckman Optima Avanti J25，美国）5000r/min将盐藻进行离心，收集藻体以及上清液。藻体分两份，一份用PBS清洗两遍后再次离心收集藻体，留待测定盐藻吸收的砷含量。另一份用NaCl清洗两遍后收集藻体，留待结合PBS处理藻样测定盐藻富集的砷含量。上清液加7.5ml去离子水、1ml硫脲抗坏血酸、0.5mlHCL后摇匀，留待测定培养液中的砷浓度。
1．3．2 盐藻OD值测定
培养1、3、5、7、9天的盐藻取样摇匀后，在固定时间用酶标仪（SMP500，美国MD公司）测定盐藻OD值，以培养时间为横坐标，以对应的OD绘制盐藻的生长曲线。
1．3．3 盐藻吸收As和富集As的测定
用PBS清洗两遍后再次离心收集藻体，测定盐藻吸收的砷含量。用NaCl清洗两遍后收集藻体，结合PBS处理藻样测定盐藻富集的砷含量。上清液加7.5ml去离子水、1ml硫脲抗坏血酸、0.5mlHCL后摇匀，留待测定培养液中的砷浓度。
1．3．4 盐藻内As形态测定
待测盐藻中加入1%浓硝酸1ml摇匀后超声10min，离心10min后再超声10min离心10min，之后采用高效液相色谱法（HPLC）测定[6]，HPLC优化后的检测条件为流动相为17.5mmol/L6.1，等度洗脱；进样体积100ul；载流：5％盐酸；还原剂：1.5％的硼氢化钾和0.5％的氢氧化钾；屏蔽气：700mL/min；载气：Ar，600mL/min；光电倍增管电压：270V；灯电流：100mA
2 结果与分析
2．1 不同处理条件下盐藻细胞生长情况
OD值随培养天数稳步增长，证明盐藻的浓度随培养天数稳步增长，呈现一定的规律。其中加As样细胞浓度要明显低于无As样，表明亚砷酸盐的胁迫明显抑制了盐藻的生长。而对于加As样来说，缺P条件培养下盐藻的OD值明显高于正常P条件培养的盐藻，证明缺P条件下有利于盐藻对砷的解毒。第九天的盐藻浓度近似于第七天，即此时盐藻已达到稳定期，盐藻浓度将不再上升。
2．2 不同处理条件下盐藻对As的吸收富集测定
盐藻吸收和富集的砷浓度随培养天数呈现一种有规律的增加，并在第七天时达到了最大值，在第九天有大幅的下降，说明盐藻对砷的吸收和富集有一个最大限度，在达到盐藻对砷的吸收富集上限后会通过解毒机制将砷外排。在缺磷和正常磷培养条件下，盐藻的富集砷含量都要大于吸收砷含量，且富集砷的含量接近吸收砷含量的二倍。在缺磷条件下盐藻对砷的吸收富集量要明显大于正常P培养条件下的盐藻，说明了缺磷的培养条件更利于盐藻对水体中砷的吸附和吸收。盐藻会将大量的砷富集于藻体表面，再逐步的吸收至胞内。
2．3 上清液中总As的测定
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法1
1.1 藻种与培养条件 1
1.2 实验设计 2
1.3 测定项目与方法 2
1.3.1 处理方法2
1.3.2 盐藻OD值测定2
1.3.3盐藻吸收As和富集As的测定2
1.3.4盐藻内As形态测定2
2 结果与分析2
2.1不同P条件下盐藻细胞生长情况3
2.2盐藻对As的吸收富集测定3
2.3上清液中总As的测定3
2.4盐藻中As形态的测定4
3 讨论 4
致谢5
参考文献5
盐藻对亚砷酸盐的吸收和代谢的研究
引言
引言
对于生物来说，砷是非生命所需元素，为适应环境中的砷，生物在长期的进化过程中发展出一系列的砷解毒机制，以降低砷对其自身的毒害。目前关于砷氧化的研究正在逐步深入，自从第一株As(III)氧化菌在1918年首次被报道[3]，随着研究的发展，越来越多的As(III)氧化菌被发现。汪耀和王革娇等在2010年鉴定出一株新型亚砷酸氧化菌Sinorhizobium sp．GW3，直到现在，王革娇所在的实验室已从我国不同砷污染源分离鉴定出近20种As(III)氧化菌[4]。
随着工业的发展，人为因素导致的海洋砷污染已成为广泛存在的问题。有些海洋藻类对砷的吸收能力很强，胞内的砷含量可以达到海水中砷含量
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
的几个数量级，因此海洋微藻对砷的吸收富集以及转化即成为研究热点。海洋微藻中，由于盐藻的生存条件最宽泛，所以盐藻的分布范围也相当广泛，且砷具有较强的砷富集能力，这些条件使得利用盐藻作为修复砷污染水体的生物修复剂成为可能。本实验即旨在探讨盐藻对亚砷酸盐的吸收与富集。盐藻在利用硝酸盐和磷酸盐的同时，由于氮、磷、砷为同组元素，可能盐藻会通过吸收磷酸盐、硝酸盐的途径来吸收砷酸盐、亚砷酸盐，这可能是盐藻能大量吸收富集海水砷的机制。
本次实验设置了正常P和十分之一P两个不同的培养背景，一共经过九天的培养。收集并处理藻样，每隔两天测定其OD值，测定盐藻胞内吸收的砷含量以及富集在表面的砷含量，上清液中的砷浓度，以及胞内砷的形态测定。
1 材料与方法
1．1 藻种与培养条件
盐藻购自山东青岛中国科学院海洋生物种质库。盐藻的培养需使用f/2培养基[5]，ph调至7.5，并高压蒸汽灭菌(121℃灭菌30min)，盐藻的初始细胞密度为5×104cellmL–1?。培养基盐度为65、光照条件为12 h 光照、12 h黑暗(光强3000lx)、温度白天30℃、晚上25℃、培养时间为9 d。
1．2 实验设计
共设置四组，第一组为1/10含量P即0.112mg/L不加As、第二组为正常含量P即1.12mg/L不加As、第三组为1/10含量P加As（Ⅲ）112μg/L、第四组为正常含量P加As（Ⅲ）112μg/L。共培养9天。并设置两个空白对照（不加砷），每隔浓度设置三个平行试验。每隔两天测定其OD值、盐藻吸收和富集的砷含量、上清液中的砷含量，胞内砷形态并根据数据分析其解毒机制。
1．3 测定项目与方法
1．3．1 处理方法
用高速冷冻离心机（Beckman Optima Avanti J25，美国）5000r/min将盐藻进行离心，收集藻体以及上清液。藻体分两份，一份用PBS清洗两遍后再次离心收集藻体，留待测定盐藻吸收的砷含量。另一份用NaCl清洗两遍后收集藻体，留待结合PBS处理藻样测定盐藻富集的砷含量。上清液加7.5ml去离子水、1ml硫脲抗坏血酸、0.5mlHCL后摇匀，留待测定培养液中的砷浓度。
1．3．2 盐藻OD值测定
培养1、3、5、7、9天的盐藻取样摇匀后，在固定时间用酶标仪（SMP500，美国MD公司）测定盐藻OD值，以培养时间为横坐标，以对应的OD绘制盐藻的生长曲线。
1．3．3 盐藻吸收As和富集As的测定
用PBS清洗两遍后再次离心收集藻体，测定盐藻吸收的砷含量。用NaCl清洗两遍后收集藻体，结合PBS处理藻样测定盐藻富集的砷含量。上清液加7.5ml去离子水、1ml硫脲抗坏血酸、0.5mlHCL后摇匀，留待测定培养液中的砷浓度。
1．3．4 盐藻内As形态测定
待测盐藻中加入1%浓硝酸1ml摇匀后超声10min，离心10min后再超声10min离心10min，之后采用高效液相色谱法（HPLC）测定[6]，HPLC优化后的检测条件为流动相为17.5mmol/L6.1，等度洗脱；进样体积100ul；载流：5％盐酸；还原剂：1.5％的硼氢化钾和0.5％的氢氧化钾；屏蔽气：700mL/min；载气：Ar，600mL/min；光电倍增管电压：270V；灯电流：100mA
2 结果与分析
2．1 不同处理条件下盐藻细胞生长情况
OD值随培养天数稳步增长，证明盐藻的浓度随培养天数稳步增长，呈现一定的规律。其中加As样细胞浓度要明显低于无As样，表明亚砷酸盐的胁迫明显抑制了盐藻的生长。而对于加As样来说，缺P条件培养下盐藻的OD值明显高于正常P条件培养的盐藻，证明缺P条件下有利于盐藻对砷的解毒。第九天的盐藻浓度近似于第七天，即此时盐藻已达到稳定期，盐藻浓度将不再上升。
2．2 不同处理条件下盐藻对As的吸收富集测定
盐藻吸收和富集的砷浓度随培养天数呈现一种有规律的增加，并在第七天时达到了最大值，在第九天有大幅的下降，说明盐藻对砷的吸收和富集有一个最大限度，在达到盐藻对砷的吸收富集上限后会通过解毒机制将砷外排。在缺磷和正常磷培养条件下，盐藻的富集砷含量都要大于吸收砷含量，且富集砷的含量接近吸收砷含量的二倍。在缺磷条件下盐藻对砷的吸收富集量要明显大于正常P培养条件下的盐藻，说明了缺磷的培养条件更利于盐藻对水体中砷的吸附和吸收。盐藻会将大量的砷富集于藻体表面，再逐步的吸收至胞内。
2．3 上清液中总As的测定
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