木聚糖酶的表达与纯化
木聚糖酶是一种能把木聚糖降解成为低聚木糖和木糖的复合酶系，它能够降解自然界中大量存在的半纤维素。该酶可以从动物、植物和微生物中获得。如今，木聚糖酶在饲料、造纸、食品和酿酒等行业中有着广泛的应用前景，不同行业对于木聚糖酶的需求也不同，这就需要开发出适合不同行业需求的酶。又因为酶的分离纯化是进行酶学性质研究、分子研究的前提条件，是成功确定氨基酸序列和三维结构的基础，因此木聚糖酶的分离纯化尤为重要。目前关于木聚糖酶的分离纯化有很多的方法，主要分为特异性分离和非特异性分离。但是每种分离方法的操作都十分复杂，并且有着很大局限性，因此探究一种新的方法来获得更高纯度的蛋白很是必要。本文通过木聚糖酶在微生物中诱导表达出木聚糖蛋白，利用亲和层析，用His标签标记木聚糖蛋白，在Ni柱中层析，从而获得高纯度的木聚糖蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1供试材料 2
1.1.1 供试药品 2
1.1.2 仪器设备3
1.2实验方法 4
1.2.1 技术路线4
1.2.2 实验步骤4
1.2.2.1木聚糖酶的表达纯化4
1.2.2.2电泳4
1.2.2.3 结晶5
2 结果与分析5
2.1 木聚糖酶的表达5
2.2 纯化的原理5
2.3 木聚糖酶的纯化5
2.4 木聚糖酶的结晶6
3讨论7
致谢7
参考文献8
木聚糖酶的表达与纯化
引言
引言
木聚糖(xylan)是一种存在于植物细胞壁中的异质多糖，约占植物细胞干重的15%35%，是植物半纤维素(hemicellose)的主要成分[1]。大多数木聚糖是一种结构复杂的、具有高度分枝的异质多糖，含有许多不同的取代基。木聚糖的生物降解也因此需要一个复杂的酶系统，通过其中各种组分的相互协同作用来降解木聚糖。由于它能够降解自然界中大量存在的半纤维素，可以从动物、植物和微生物中获得。
如今， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
由于用来生产饲料、用于造纸等作物原料中都含有大量的木聚糖，因此木聚糖酶在饲料、造纸、食品和酿酒等行业中显示出了广泛的应用前景[2]。木聚糖是抗营养因子，而在饲料中大量存在木聚糖不利于动物对饲料中营养因子的吸收利用；木聚糖会影响纸浆中木质素的溶出效果，为了使纸浆更白更亮，在漂白过程中氯化物使用量也就无法精准控制，浪费原料增加成本[3]；果蔬的外层是一层坚硬的细胞壁，其可溶于木聚糖、果胶等粘性物质，会使提取液粘度太大而造成后续的浓缩干燥工作难以进行[4]。木聚糖酶对木聚糖的降解，可以很好的解决上述工业中存在的诸多问题。
国际上有关微生物木聚糖酶的诱导与调节机理，酶的提纯、鉴定方法，以及木聚糖酶基因分子的克隆与表达研究较多[5]。我国有关木聚糖酶的研究起步较晚，且主要是对海枣曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽抱杆菌、串珠链抱菌、链霉菌、环状芽抱杆菌、碱性假单胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究，且不同来源的木聚糖酶它们的酶学性质也有所差异[6]。由于木聚糖酶显示出越来越重要的应用价值以及在生物工程技术的重要前景，现在己经有越来越多的科研人员加入到木聚糖酶的开发研究[7]，如高产菌株的培育、工程菌的构建、优化培养环境、高纯度无纤维素酶污染的木聚糖酶等。对于木聚糖酶的研究不断深入，在人类发展过程中遇到的能源、粮食、环境等诸多问题上木聚糖酶将发挥出它所特有的优势和潜力，为人类的发展做出贡献[8]。
目前的木聚糖酶的分离纯化技术主要分为两种，特异性分离纯化和非特异性分离纯化。在非特异性分离纯化中硫酸铵沉淀法是工业上酶分离纯化中常用的方法，可以同时达到浓缩与粗分离的目的[9]。但对于低分子量木聚糖酶的纯化来说，由于回收率太低而限制了其适用范围。超滤浓缩分离也是一种应用于木聚糖酶分离纯化中的方法。Christoph W在分离纯化Thermotogamaritina的XynA木聚糖酶时，对粗提液首先采用膜浓缩分离，纯化倍数4.9。分离纯化中选择膜的截留分子量应该大于目的酶的分子量的30%～50%，以保证截留的成功。离子交换层析技术是获得高纯度木聚糖酶常采用的方法。原理是根据目的酶的等电点选择合适的分离树脂，对于弱酸性及中性的木聚糖酶多采用阴离子交换树脂。凝胶过滤是一种根据分子大小不同分离纯化木聚糖酶的常用分离方法之一，但是由于酶与凝胶介质(琼脂糖或葡聚糖)的相互作用会影响酶的分离纯化。特异性分离纯化技术复杂，限制比较多，只适用一些比较特殊的木聚糖酶[10]。
本实验采用Ni柱亲和层析法[11]，摸索出木聚糖酶的表达与纯化方法，以前还未有人做过相类似的实验，通过此实验可以获得高纯度的木聚糖酶，为以后对木聚糖酶的性质和结构的改造打下坚实的基础。
1.材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试药品
实验所用试剂
名称
纯度
生产厂家
质粒（WT）
≥99%
金唯智
Rosetta（DE3）
一
LB
一
MDBio
无水硫酸镁
分析纯
上海统亚化工科技发展有限公司
IPTG
≥99%
Biosharp
(NH4)SO4
分析纯
南京化学试剂有限公司
丙三醇（甘油）
分析纯
南京化学试剂有限公司
PMSF
≥98.5%
西格玛奥德里奇
DTT
≥99%
阿拉丁
Trizma base
≥99%
VETEC
Imidazole
≥99%
阿拉丁
MgCl26H2O
分析纯
西陇化工股份有限公司
Na2HPO4
分析纯
南京化学试剂有限公司
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1供试材料 2
1.1.1 供试药品 2
1.1.2 仪器设备3
1.2实验方法 4
1.2.1 技术路线4
1.2.2 实验步骤4
1.2.2.1木聚糖酶的表达纯化4
1.2.2.2电泳4
1.2.2.3 结晶5
2 结果与分析5
2.1 木聚糖酶的表达5
2.2 纯化的原理5
2.3 木聚糖酶的纯化5
2.4 木聚糖酶的结晶6
3讨论7
致谢7
参考文献8
木聚糖酶的表达与纯化
引言
引言
木聚糖(xylan)是一种存在于植物细胞壁中的异质多糖，约占植物细胞干重的15%35%，是植物半纤维素(hemicellose)的主要成分[1]。大多数木聚糖是一种结构复杂的、具有高度分枝的异质多糖，含有许多不同的取代基。木聚糖的生物降解也因此需要一个复杂的酶系统，通过其中各种组分的相互协同作用来降解木聚糖。由于它能够降解自然界中大量存在的半纤维素，可以从动物、植物和微生物中获得。
如今， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
由于用来生产饲料、用于造纸等作物原料中都含有大量的木聚糖，因此木聚糖酶在饲料、造纸、食品和酿酒等行业中显示出了广泛的应用前景[2]。木聚糖是抗营养因子，而在饲料中大量存在木聚糖不利于动物对饲料中营养因子的吸收利用；木聚糖会影响纸浆中木质素的溶出效果，为了使纸浆更白更亮，在漂白过程中氯化物使用量也就无法精准控制，浪费原料增加成本[3]；果蔬的外层是一层坚硬的细胞壁，其可溶于木聚糖、果胶等粘性物质，会使提取液粘度太大而造成后续的浓缩干燥工作难以进行[4]。木聚糖酶对木聚糖的降解，可以很好的解决上述工业中存在的诸多问题。
国际上有关微生物木聚糖酶的诱导与调节机理，酶的提纯、鉴定方法，以及木聚糖酶基因分子的克隆与表达研究较多[5]。我国有关木聚糖酶的研究起步较晚，且主要是对海枣曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽抱杆菌、串珠链抱菌、链霉菌、环状芽抱杆菌、碱性假单胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究，且不同来源的木聚糖酶它们的酶学性质也有所差异[6]。由于木聚糖酶显示出越来越重要的应用价值以及在生物工程技术的重要前景，现在己经有越来越多的科研人员加入到木聚糖酶的开发研究[7]，如高产菌株的培育、工程菌的构建、优化培养环境、高纯度无纤维素酶污染的木聚糖酶等。对于木聚糖酶的研究不断深入，在人类发展过程中遇到的能源、粮食、环境等诸多问题上木聚糖酶将发挥出它所特有的优势和潜力，为人类的发展做出贡献[8]。
目前的木聚糖酶的分离纯化技术主要分为两种，特异性分离纯化和非特异性分离纯化。在非特异性分离纯化中硫酸铵沉淀法是工业上酶分离纯化中常用的方法，可以同时达到浓缩与粗分离的目的[9]。但对于低分子量木聚糖酶的纯化来说，由于回收率太低而限制了其适用范围。超滤浓缩分离也是一种应用于木聚糖酶分离纯化中的方法。Christoph W在分离纯化Thermotogamaritina的XynA木聚糖酶时，对粗提液首先采用膜浓缩分离，纯化倍数4.9。分离纯化中选择膜的截留分子量应该大于目的酶的分子量的30%～50%，以保证截留的成功。离子交换层析技术是获得高纯度木聚糖酶常采用的方法。原理是根据目的酶的等电点选择合适的分离树脂，对于弱酸性及中性的木聚糖酶多采用阴离子交换树脂。凝胶过滤是一种根据分子大小不同分离纯化木聚糖酶的常用分离方法之一，但是由于酶与凝胶介质(琼脂糖或葡聚糖)的相互作用会影响酶的分离纯化。特异性分离纯化技术复杂，限制比较多，只适用一些比较特殊的木聚糖酶[10]。
本实验采用Ni柱亲和层析法[11]，摸索出木聚糖酶的表达与纯化方法，以前还未有人做过相类似的实验，通过此实验可以获得高纯度的木聚糖酶，为以后对木聚糖酶的性质和结构的改造打下坚实的基础。
1.材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试药品
实验所用试剂
名称
纯度
生产厂家
质粒（WT）
≥99%
金唯智
Rosetta（DE3）
一
LB
一
MDBio
无水硫酸镁
分析纯
上海统亚化工科技发展有限公司
IPTG
≥99%
Biosharp
(NH4)SO4
分析纯
南京化学试剂有限公司
丙三醇（甘油）
分析纯
南京化学试剂有限公司
PMSF
≥98.5%
西格玛奥德里奇
DTT
≥99%
阿拉丁
Trizma base
≥99%
VETEC
Imidazole
≥99%
阿拉丁
MgCl26H2O
分析纯
西陇化工股份有限公司
Na2HPO4
分析纯
南京化学试剂有限公司
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