黄芩内源酶提取及酶学性质研究
目 录
1引言 1
1.1 黄芩药材 1
1.2 黄芩活性成分 1
1.3 黄芩的药理作用 2
1.4 黄芩活性成分的检测方法 3
2实验部分 4
2.1 实验仪器及试剂 4
2.2 黄芩内源酶提取 5
2.3 分离纯化方案的确定 6
2.4 含量测定 8
2.5 酶活力测定 8
3 结果与讨论 10
3.1 内源酶提取液蛋白浓度测定 10
3.2 内源酶活力测定 14
3.3 讨论 16
结论 17
致谢 18
参考文献 19
1引言
1.1 黄芩药材
中药黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，在我国药用历史悠久，最早收载于《神农本草经》[1]，具有清热、燥湿，减压止泻，止血安胎等作用，为清凉解热药，用于湿温、暑温、湿热痞满，高热烦渴，泻痢，黄谊，肺热咳嗽，痈肿疮毒，胎动不安等[2]。黄芩是一种典型的大宗药材，为草根药的上品。又名枯芩、条芩、子芩，其性寒味苦[3]。现代药理学研究表明黄芩具有抗肺炎衣原体所致的动脉粥样硬化作用，对缺血再灌注损伤的大脑和心肌具有保护作用，对不同原因引起的肝损伤具有保护作用，能显著促进成纤维细胞增殖，对人牙周膜成纤维细胞具有保护作用，在体外对某些寄生虫均有明显的抑制和杀灭作用[4]。
1.2 黄芩活性成分
黄芩根是清热解毒最常用的中药，其主要成分为黄酮化合物，如：黄芩苷（baicalin, baicalein-7-O-glucuronide）、汉黄芩苷（wogonoside *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
, wogonin-7-O-glucuronide）黄芩素（baicalein）、汉黄芩素（wogonin），其化学结构如图1所示。此外黄芩中还含有β-谷甾醇、苯甲酸、黄芩细淀粉，根组织中还含有黄芩酶能促进黄芩苷和汉黄芩苷水解，生成黄芩黄素和汉黄芩黄素。黄芩黄素分子中带有3个邻位酚羟基，性质不稳定，容易被氧化转为醌类衍生物而显绿色，这是保存不当的黄芩能够变成绿色的原因。茎叶中含有卯黄芩甙及黄芩甙。汉黄芩苷和黄芩新素是黄芩中特有的成分[5]。
图1黄芩中主要黄酮类化合物的化学结构
1.3 黄芩的药理作用
1.3.1 抗炎作用
黄芩的抗炎作用，曾报告黄芩苷、黄芩素能明显降低炎症时小鼠耳毛细血管通透性亢进及低气压所致小鼠实验性肺出血，腹腔注射100mg/kg对鹿角菜胶性大鼠脚爪水肿有与阿司匹林相似的抗炎作用。对于大鼠的酵母性脚肿胀，40g/kg黄芩水提液灌服有显著抑制作用。黄芩70%甲醇提取物及黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素也均能明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进及化合物48/80所致大鼠脚爪水肿，但对鹿角菜胶性脚肿及肉芽组织增生无效。对于大鼠佐剂性关节炎，黄芩对继发性损害有预防保护作用，能抑制骨质退化和破坏，但无治疗作用，对原发性损害也无效[6]。
1.3.2 解热作用
曾有报道认为黄芩对酵母、伤寒菌苗所致家兔发热有解热效果[6]，黄芩苷通过抑制单核细胞DNA，Pr合成及Ca2+内流，阻止内生致热源的产生，使其具有一定的解热作用[7]。李倩楠[8]等实验表明黄芩苷有明显的解热作用,其作用机制可能主要与减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量有关。
1.3.3 解毒作用
黄芩醇提物静脉注射可显著对抗士的宁所致蛙、猫、犬等惊厥，能减低惊厥强度，降低死亡率[6]。
1.3.4 抗菌和抗病毒作用
黄芩具有的广谱抗菌、抗病毒作用，研究发现黄芩提取物在体内外对金黄色葡萄球菌抑制作用，在体内的抗感染保护作用中，黄芩水提取物的保护作用优于黄芩醇提取物；而在体外黄芩醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比黄芩水提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果好[9,10]。
1.3.5 抗肿瘤作用
随着人们对黄芩药理作用和组成成分的深入研究，发现黄芩也具有抗肿瘤功效。顾正勤[11]等采用不同浓度的黄芩苷处理细胞后，用流式细胞仪检测前列腺癌细胞DU145的凋亡率及细胞周期分布；电下观察细胞超微结构；免疫组织化学染色检测凋亡相关蛋白的表达。最终结果表明：黄芩苷能诱导前列腺癌细胞凋亡，并明显抑制癌细胞增殖，具有直接抗肿瘤作用。
1.3.6 抗氧化和清除自由基作用
多数黄酮类化合物具有一定的抗氧化作用，其黄酮类化合物结构中的2，3双键和4位羰基以及3或5位羟基对黄酮的抗氧化作用有重要贡献。黄芩中已知的黄酮成分大都具有酚羟基结构，因此是较好的抗氧化剂[12]。
1.3.7 保肝作用
王超云[13]等通过对小鼠化学性肝损伤的研究发现，黄芩苷对CCl4和D-GalN所致小鼠实验性急性肝损伤具有一定的防治作用，其作用机制与其降酶、抗脂质过氧化反应有关。李海燕[14]等采用不同浓度的黄芩苷灌胃扑热息痛造成损伤的小鼠，实验表明黄芩苷可以明显降低扑热 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
息痛所致的小鼠血中ALT和AST活性，对扑热息痛所致的小鼠肝损伤有明显的保护作用。其作用机理可能与保护和稳定肝细胞膜，降低肝细胞膜通透性，减少肝内GSH消耗，减少自由基的损害有关。姜英子[15]等通过对小鼠急性肝损伤的研究发现，黄芩苷对D-氨基半乳糖和D-氨基半乳糖与内毒素合用所致的小鼠肝损伤具有保护作用。
1.3.8 免疫作用
蔡仙德[16]等黄芩苷体内试验研究表明，黄芩具有增加免疫能力的作用，可以增加身体对病毒的抵抗能力。同时对小鼠腹腔巨噬细胞具有双向调节作用，低剂量可显著增加巨噬细胞吞噬中性红和溶菌酶含量，高剂量则起抑制作用。
1.4 黄芩活性成分的检测方法
黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分之一，许多含黄芩的中药制剂均采用黄芩苷作为质量控制指标，但其含量测定方法各异，中华人民共和国药典中黄芩苷的测定方法为高效液相色谱法。检测黄芩苷的方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层扫描法和液相色谱-串联质谱法。
高效液相色谱法（HPLC）：黄芩苷的药典测定方法为高效液相色谱法，实质上是以液体为流动相的柱层析。高效液相色谱法具有灵敏度高、特异性高、分离效能高、分析速度快、高度自动化、进样前样品处理简单、样品易回收、样品经色谱柱可不被破坏等优点。是目前黄芩苷定量分析方法中较为优越的方法，也是质量控制中较常用的方法。
紫外分光光度法（UV）：紫外分光广度法是利用黄酮类化合物分子结构具有双键、共轭双键、苯环、芳香稠环、芳香杂环或共轭烯烃的化合物在一定波长（220～350 nm）范围内的吸收度来测定该物质含量的一类光学方法。余莲[17]采用紫外分光光度法测定了清热口服液中黄芩苷含量。样品经过浓盐酸(HCl)调节pH值，沉淀加氯仿提取，75%乙醇洗脱沉淀，得到黄芩苷，在λ=278.00nm波长处测定，得到良好线性关系。
2.3 分离纯化方案的确定
将透析带中的透析液进行浓缩，至5mL左右，浓缩液过DEAE SepharoseTM Fast Flow柱，以1M NaCl溶液和Buffer B各500mL进行梯度洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集1mL洗脱液，进行蛋白含量测定和酶活性测定。分离纯化方案见图2 。
1引言 1
1.1 黄芩药材 1
1.2 黄芩活性成分 1
1.3 黄芩的药理作用 2
1.4 黄芩活性成分的检测方法 3
2实验部分 4
2.1 实验仪器及试剂 4
2.2 黄芩内源酶提取 5
2.3 分离纯化方案的确定 6
2.4 含量测定 8
2.5 酶活力测定 8
3 结果与讨论 10
3.1 内源酶提取液蛋白浓度测定 10
3.2 内源酶活力测定 14
3.3 讨论 16
结论 17
致谢 18
参考文献 19
1引言
1.1 黄芩药材
中药黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，在我国药用历史悠久，最早收载于《神农本草经》[1]，具有清热、燥湿，减压止泻，止血安胎等作用，为清凉解热药，用于湿温、暑温、湿热痞满，高热烦渴，泻痢，黄谊，肺热咳嗽，痈肿疮毒，胎动不安等[2]。黄芩是一种典型的大宗药材，为草根药的上品。又名枯芩、条芩、子芩，其性寒味苦[3]。现代药理学研究表明黄芩具有抗肺炎衣原体所致的动脉粥样硬化作用，对缺血再灌注损伤的大脑和心肌具有保护作用，对不同原因引起的肝损伤具有保护作用，能显著促进成纤维细胞增殖，对人牙周膜成纤维细胞具有保护作用，在体外对某些寄生虫均有明显的抑制和杀灭作用[4]。
1.2 黄芩活性成分
黄芩根是清热解毒最常用的中药，其主要成分为黄酮化合物，如：黄芩苷（baicalin, baicalein-7-O-glucuronide）、汉黄芩苷（wogonoside *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
, wogonin-7-O-glucuronide）黄芩素（baicalein）、汉黄芩素（wogonin），其化学结构如图1所示。此外黄芩中还含有β-谷甾醇、苯甲酸、黄芩细淀粉，根组织中还含有黄芩酶能促进黄芩苷和汉黄芩苷水解，生成黄芩黄素和汉黄芩黄素。黄芩黄素分子中带有3个邻位酚羟基，性质不稳定，容易被氧化转为醌类衍生物而显绿色，这是保存不当的黄芩能够变成绿色的原因。茎叶中含有卯黄芩甙及黄芩甙。汉黄芩苷和黄芩新素是黄芩中特有的成分[5]。
图1黄芩中主要黄酮类化合物的化学结构
1.3 黄芩的药理作用
1.3.1 抗炎作用
黄芩的抗炎作用，曾报告黄芩苷、黄芩素能明显降低炎症时小鼠耳毛细血管通透性亢进及低气压所致小鼠实验性肺出血，腹腔注射100mg/kg对鹿角菜胶性大鼠脚爪水肿有与阿司匹林相似的抗炎作用。对于大鼠的酵母性脚肿胀，40g/kg黄芩水提液灌服有显著抑制作用。黄芩70%甲醇提取物及黄芩素、黄芩苷及汉黄芩素也均能明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进及化合物48/80所致大鼠脚爪水肿，但对鹿角菜胶性脚肿及肉芽组织增生无效。对于大鼠佐剂性关节炎，黄芩对继发性损害有预防保护作用，能抑制骨质退化和破坏，但无治疗作用，对原发性损害也无效[6]。
1.3.2 解热作用
曾有报道认为黄芩对酵母、伤寒菌苗所致家兔发热有解热效果[6]，黄芩苷通过抑制单核细胞DNA，Pr合成及Ca2+内流，阻止内生致热源的产生，使其具有一定的解热作用[7]。李倩楠[8]等实验表明黄芩苷有明显的解热作用,其作用机制可能主要与减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量有关。
1.3.3 解毒作用
黄芩醇提物静脉注射可显著对抗士的宁所致蛙、猫、犬等惊厥，能减低惊厥强度，降低死亡率[6]。
1.3.4 抗菌和抗病毒作用
黄芩具有的广谱抗菌、抗病毒作用，研究发现黄芩提取物在体内外对金黄色葡萄球菌抑制作用，在体内的抗感染保护作用中，黄芩水提取物的保护作用优于黄芩醇提取物；而在体外黄芩醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比黄芩水提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果好[9,10]。
1.3.5 抗肿瘤作用
随着人们对黄芩药理作用和组成成分的深入研究，发现黄芩也具有抗肿瘤功效。顾正勤[11]等采用不同浓度的黄芩苷处理细胞后，用流式细胞仪检测前列腺癌细胞DU145的凋亡率及细胞周期分布；电下观察细胞超微结构；免疫组织化学染色检测凋亡相关蛋白的表达。最终结果表明：黄芩苷能诱导前列腺癌细胞凋亡，并明显抑制癌细胞增殖，具有直接抗肿瘤作用。
1.3.6 抗氧化和清除自由基作用
多数黄酮类化合物具有一定的抗氧化作用，其黄酮类化合物结构中的2，3双键和4位羰基以及3或5位羟基对黄酮的抗氧化作用有重要贡献。黄芩中已知的黄酮成分大都具有酚羟基结构，因此是较好的抗氧化剂[12]。
1.3.7 保肝作用
王超云[13]等通过对小鼠化学性肝损伤的研究发现，黄芩苷对CCl4和D-GalN所致小鼠实验性急性肝损伤具有一定的防治作用，其作用机制与其降酶、抗脂质过氧化反应有关。李海燕[14]等采用不同浓度的黄芩苷灌胃扑热息痛造成损伤的小鼠，实验表明黄芩苷可以明显降低扑热 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
息痛所致的小鼠血中ALT和AST活性，对扑热息痛所致的小鼠肝损伤有明显的保护作用。其作用机理可能与保护和稳定肝细胞膜，降低肝细胞膜通透性，减少肝内GSH消耗，减少自由基的损害有关。姜英子[15]等通过对小鼠急性肝损伤的研究发现，黄芩苷对D-氨基半乳糖和D-氨基半乳糖与内毒素合用所致的小鼠肝损伤具有保护作用。
1.3.8 免疫作用
蔡仙德[16]等黄芩苷体内试验研究表明，黄芩具有增加免疫能力的作用，可以增加身体对病毒的抵抗能力。同时对小鼠腹腔巨噬细胞具有双向调节作用，低剂量可显著增加巨噬细胞吞噬中性红和溶菌酶含量，高剂量则起抑制作用。
1.4 黄芩活性成分的检测方法
黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分之一，许多含黄芩的中药制剂均采用黄芩苷作为质量控制指标，但其含量测定方法各异，中华人民共和国药典中黄芩苷的测定方法为高效液相色谱法。检测黄芩苷的方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层扫描法和液相色谱-串联质谱法。
高效液相色谱法（HPLC）：黄芩苷的药典测定方法为高效液相色谱法，实质上是以液体为流动相的柱层析。高效液相色谱法具有灵敏度高、特异性高、分离效能高、分析速度快、高度自动化、进样前样品处理简单、样品易回收、样品经色谱柱可不被破坏等优点。是目前黄芩苷定量分析方法中较为优越的方法，也是质量控制中较常用的方法。
紫外分光光度法（UV）：紫外分光广度法是利用黄酮类化合物分子结构具有双键、共轭双键、苯环、芳香稠环、芳香杂环或共轭烯烃的化合物在一定波长（220～350 nm）范围内的吸收度来测定该物质含量的一类光学方法。余莲[17]采用紫外分光光度法测定了清热口服液中黄芩苷含量。样品经过浓盐酸(HCl)调节pH值，沉淀加氯仿提取，75%乙醇洗脱沉淀，得到黄芩苷，在λ=278.00nm波长处测定，得到良好线性关系。
2.3 分离纯化方案的确定
将透析带中的透析液进行浓缩，至5mL左右，浓缩液过DEAE SepharoseTM Fast Flow柱，以1M NaCl溶液和Buffer B各500mL进行梯度洗脱，洗脱流速为1mL/min，每管收集1mL洗脱液，进行蛋白含量测定和酶活性测定。分离纯化方案见图2 。
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