小麦和玉米中hma3基因的功能验证(附件)
镉是一种对人体有害的重金属，降低食用作物中镉含量是降低镉污染对人体健康伤害的有效途径之一。小麦、玉米均为世界上排名前列的粮食作物，水稻OsHMA3及拟南芥AtHMA3基因对镉的解读机制方面迄今已有较多相关研究，根据本实验室前期研究可知HMA3基因在作物镉的代谢中参与重要作用，其将镉转运至液泡中，通过区室化作用缓解镉对作物细胞的毒害，并阻止镉继续向地上部运输的功能已得到验证。同时也已得知小麦、玉米、水稻中积累镉的能力存在差异，水稻地上部积累镉的能力较强，即根部HMA3基因转运镉的能力较弱。本课题致力于探究在可食用作物小麦和玉米中的重金属镉的积累转运与分布，进而结合之前报道过的HMA3基因及其在水稻方面的研究进展，探究该基因在小麦和玉米镉的转运中的贡献。通过水培实验，发现在小麦和玉米中镉主要积累在根部，小麦在地上部和根部的积累量是玉米的2-3倍。小麦和玉米的镉转运量在0.1-0.2之间。不同物种之间以及同一物种不同品种之间，并不存在显著的差异。并通过对小麦和玉米中的TaHMA3基因和ZmHMA3基因进行定量分析，发现ZmHMA3基因在玉米中几乎没有表达。以及通过酵母异源表达实验验证进行具体HMA3功能的验证。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1．1 作物植株培养 3
1．1．1 材料 3
1．1．2 培养过程 3
1．2 不同作物HMA3克隆载体构建 3
1．2．1 提取总RNA 3
1．2．2 反转录成cDNA 4
1．2．2 设计小麦、玉米中HMA3特异引物 4
1．2．2 克隆载体构建并测序验证 5
1．3 实时荧光定量PCR 5
1．3．1 材料 5
1．3．2 实验方法 5
1．4 测定作物中镉含量 6
1．4．1 材料 6
1．4．2 实验步骤 6
2 结果与分析 6
2．1 作物镉含量测定 6
2．1．1 不同作物对镉元素的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
吸收与转运 7
2．1．2 不同作物对其他金属元素的吸收与转运 7
2．2 RTPCR表达差异分析 11
3 讨论 12
3．1 结论 12
3．2 实验意义 13
致谢 13
参考文献： 13
小麦和玉米中HMA3基因的功能验证
引言
镉是一种对人体有害的重金属，被世界卫生组织划为一级致癌物质，且由于污水灌溉、工业粉尘扩散沉降等，导致越来越多的镉进入农田，镉污染危害随工业发展而急剧增加，且具有范围广、易积累、不可逆等特点。而对于植物，土壤中的镉在转移进入植物体内各组织器官后才会产生毒害作用，且植物地上部分对镉毒害作用更为敏感，镉的积累会对植物生长发育产生毒害及严重阻碍作用，在形态方面表现为生长迟缓、褪绿、植株矮小等症状，影响作物质量及产量。水稻、玉米、小麦作为世界上排名前列的粮食作物，其质量及产量关系人类食用作物安全，降低食用作物中镉的含量是降低镉污染对人体健康伤害的有效途径之一［1］。/
图1 植物PCs解毒机制
Fig.1 Mechanism of detoxifcation by phytochelatins
在生理生化机理上，植物适应镉胁迫的主要包括：一为镉在细胞中区室化可减轻镉对植物的毒害，二为植物可通过提高SOD、POD、CAT的活性以提高植物对镉的耐性。在分子生物学上，现今生物学研究进展为，镉能诱导植物形成镉结合蛋白（Cdbinging protein，简称CdBp），其解毒过程如图2所示，但在基因水平研究植物抗污染报道较少。对于CdPC络合物合成酶的基因编码也有待于进一步研究。［2］
P1BATPase的作用机制为通过水解ATP 跨膜运送阳离子，可选择性吸收转运Cu+、Cu2+、Zn2+等植物生长必需的金属离子及Cd2+、Pb2+等部分非必需重金属离子, 因此又称为重金属转运ATP酶(heavy metal transporting ATPase, HMA), 在作物对重金属的抗性、吸收、转运过程中及植物修复重金属污染土壤方面起着重要的作用。HMA是通过水解ATP跨膜作用机制运送重金属阳离子的转运蛋白, 属PATPase家族中一个亚类。HMA基因家族是植物吸收、转运重金属的重要组成部分。根据现有研究可知, 不同HMA基因对重金属具有一定的选择性。Axelsen和Palmgren［4］依据转运重金属的特异性, 将HMA基因家族蛋白分为两类: 第一类为Zn亚类, 转运重金属离子Zn2+、Cd2+、Pb2+等; 第二类为Cu亚类, 转运重金属离子如Cu+ 、Ag+等。水稻OsHMA3及拟南芥AtHMA3基因对镉的解读机制方面相对来说现已有较多相关研究，拟南芥的AtHMA1~4、水稻OsHMA1~3属于Zn亚类, 拟南芥AtHMA5~8、水稻OsHMA4~9属于Cu亚类。不同HMA蛋白结构组成的差异, 决定了它们吸收和转运重金属的不同,尽管具体关联性机制还有待研究［3］。
其中水稻OsHMA3作为根系中镉转运蛋白，也是目前为止唯一一个通过正向遗传学手段克隆的水稻镉积累QTL，属于P1B型ATP酶家族成员。OsHMA3主要在根细胞中的液泡膜中表达[5]，具有将镉从胞质运进液泡从而隔离起来的功能，例如高镉籼稻品种携带功能缺失型OsHMA3等位基因，其中的OsHMA3功能缺失突变阻断了镉进入液泡的通道，从而使得木质部和地上部的镉含量上升［6～8］。又如Morel等(2009) ［9］研究发现, 过量表达AtHMA3可提高拟南芥植株对Zn 、Cd、Pb的耐受性,且其中Cd的吸收量会增加2～3倍。Sasaki等［10］在水稻中发现，P型ATPases家族中的OsHMA3基因过量表达可以降低茎秆和籽粒中Cd浓度，但是籽粒中其他必需营养元素的含量并未减少，如Zn。这说明OsHMA3能将进入细胞的镉运输至液泡中，通过区室化作用缓解镉对细胞的毒害，并阻止镉继续向地上部运输。以及OsHMA3的等位基因OsHMA3mc能编码具有功能缺陷性的OsHMA3转运蛋白，该转运蛋白无法将镉运输到液泡中隔离起来，从而增加了地上部中镉的含量。以上这些研究均表明HMA3基因具有作为离子泵排出镉或者缓冲其毒性的功能。HMA3基因在水稻、拟南芥等作物镉的代谢中参与重要作用，将镉转运至液泡中，通过区室化作用缓解镉对作物细胞的毒害，并阻止镉继续向地上部运输。［11］
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1．1 作物植株培养 3
1．1．1 材料 3
1．1．2 培养过程 3
1．2 不同作物HMA3克隆载体构建 3
1．2．1 提取总RNA 3
1．2．2 反转录成cDNA 4
1．2．2 设计小麦、玉米中HMA3特异引物 4
1．2．2 克隆载体构建并测序验证 5
1．3 实时荧光定量PCR 5
1．3．1 材料 5
1．3．2 实验方法 5
1．4 测定作物中镉含量 6
1．4．1 材料 6
1．4．2 实验步骤 6
2 结果与分析 6
2．1 作物镉含量测定 6
2．1．1 不同作物对镉元素的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
吸收与转运 7
2．1．2 不同作物对其他金属元素的吸收与转运 7
2．2 RTPCR表达差异分析 11
3 讨论 12
3．1 结论 12
3．2 实验意义 13
致谢 13
参考文献： 13
小麦和玉米中HMA3基因的功能验证
引言
镉是一种对人体有害的重金属，被世界卫生组织划为一级致癌物质，且由于污水灌溉、工业粉尘扩散沉降等，导致越来越多的镉进入农田，镉污染危害随工业发展而急剧增加，且具有范围广、易积累、不可逆等特点。而对于植物，土壤中的镉在转移进入植物体内各组织器官后才会产生毒害作用，且植物地上部分对镉毒害作用更为敏感，镉的积累会对植物生长发育产生毒害及严重阻碍作用，在形态方面表现为生长迟缓、褪绿、植株矮小等症状，影响作物质量及产量。水稻、玉米、小麦作为世界上排名前列的粮食作物，其质量及产量关系人类食用作物安全，降低食用作物中镉的含量是降低镉污染对人体健康伤害的有效途径之一［1］。/
图1 植物PCs解毒机制
Fig.1 Mechanism of detoxifcation by phytochelatins
在生理生化机理上，植物适应镉胁迫的主要包括：一为镉在细胞中区室化可减轻镉对植物的毒害，二为植物可通过提高SOD、POD、CAT的活性以提高植物对镉的耐性。在分子生物学上，现今生物学研究进展为，镉能诱导植物形成镉结合蛋白（Cdbinging protein，简称CdBp），其解毒过程如图2所示，但在基因水平研究植物抗污染报道较少。对于CdPC络合物合成酶的基因编码也有待于进一步研究。［2］
P1BATPase的作用机制为通过水解ATP 跨膜运送阳离子，可选择性吸收转运Cu+、Cu2+、Zn2+等植物生长必需的金属离子及Cd2+、Pb2+等部分非必需重金属离子, 因此又称为重金属转运ATP酶(heavy metal transporting ATPase, HMA), 在作物对重金属的抗性、吸收、转运过程中及植物修复重金属污染土壤方面起着重要的作用。HMA是通过水解ATP跨膜作用机制运送重金属阳离子的转运蛋白, 属PATPase家族中一个亚类。HMA基因家族是植物吸收、转运重金属的重要组成部分。根据现有研究可知, 不同HMA基因对重金属具有一定的选择性。Axelsen和Palmgren［4］依据转运重金属的特异性, 将HMA基因家族蛋白分为两类: 第一类为Zn亚类, 转运重金属离子Zn2+、Cd2+、Pb2+等; 第二类为Cu亚类, 转运重金属离子如Cu+ 、Ag+等。水稻OsHMA3及拟南芥AtHMA3基因对镉的解读机制方面相对来说现已有较多相关研究，拟南芥的AtHMA1~4、水稻OsHMA1~3属于Zn亚类, 拟南芥AtHMA5~8、水稻OsHMA4~9属于Cu亚类。不同HMA蛋白结构组成的差异, 决定了它们吸收和转运重金属的不同,尽管具体关联性机制还有待研究［3］。
其中水稻OsHMA3作为根系中镉转运蛋白，也是目前为止唯一一个通过正向遗传学手段克隆的水稻镉积累QTL，属于P1B型ATP酶家族成员。OsHMA3主要在根细胞中的液泡膜中表达[5]，具有将镉从胞质运进液泡从而隔离起来的功能，例如高镉籼稻品种携带功能缺失型OsHMA3等位基因，其中的OsHMA3功能缺失突变阻断了镉进入液泡的通道，从而使得木质部和地上部的镉含量上升［6～8］。又如Morel等(2009) ［9］研究发现, 过量表达AtHMA3可提高拟南芥植株对Zn 、Cd、Pb的耐受性,且其中Cd的吸收量会增加2～3倍。Sasaki等［10］在水稻中发现，P型ATPases家族中的OsHMA3基因过量表达可以降低茎秆和籽粒中Cd浓度，但是籽粒中其他必需营养元素的含量并未减少，如Zn。这说明OsHMA3能将进入细胞的镉运输至液泡中，通过区室化作用缓解镉对细胞的毒害，并阻止镉继续向地上部运输。以及OsHMA3的等位基因OsHMA3mc能编码具有功能缺陷性的OsHMA3转运蛋白，该转运蛋白无法将镉运输到液泡中隔离起来，从而增加了地上部中镉的含量。以上这些研究均表明HMA3基因具有作为离子泵排出镉或者缓冲其毒性的功能。HMA3基因在水稻、拟南芥等作物镉的代谢中参与重要作用，将镉转运至液泡中，通过区室化作用缓解镉对作物细胞的毒害，并阻止镉继续向地上部运输。［11］
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