高效贫营养微生物复合制剂的制备与应用研究
目 录
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2国内外研究进展情况 1
1.2.1 贫营养微生物研究发展 1
1.2.2微胶囊技术的发展 2
1.3本课题研究的意义 4
2 实验材料和实验方法 5
2.1 实验主要仪器 5
2.2 实验主要试剂 6
2.3 实验方法 6
3 实验结果与讨论. 12
3.1 贫营养细菌培养 12
3.2 乳化法制备微胶囊. 14
3.3 净水实验 23
结论 28
致谢 29
参考文献 30
1 绪论
1.1 研究背景
微污染水体是指随着国民经济的日益发展，我国饮用水水源的微污染问题日益严峻，常规的混凝过滤净水工艺难以保障水质达标。当前，筛选高效贫营养微生物对饮用水进行深度处理已成为净水工艺研究领域的重要分支。优良的贫营养细菌可以和常规净水菌剂形成一个完整的净水体系，把污染降低到更低的水平。由于单一贫营养微生物的净化效果很难满足水体净化的各方面的需求，将鉴定出的高效贫营养微生物进行复配，研发贫营养微生物制剂，具有重要而迫切的现实意义。菌剂活性的高低对使用效果的好坏有至关重要的影响，而制备方法又是其活性的决定因素。传统的“载体+抑制剂”的储存方法，无法有效保持第一代菌种活性，因此使用时的品质无法有效保障，且保质期较短。微胶囊封装技术能有效抑制微生物的代谢作用：微胶囊封装技术的封闭层使微生物处于休眠状态，不受温度、湿度、氧化等外部因素影响；溶于水后，其保护层可被迅速溶解，从而保证高剂量的第一代菌株投入工作。因此对采用微胶囊封装技术制备微生物菌剂，在较长的保质 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
期内保持菌剂的高活性的研究具有深远意义。
1.2 国内外研究进展情况
1.2.1 贫营养微生物研究发展
在贫营养净水微生物的分离提纯方面国内学者取得了较多的研究成果，如华中科技大学的夏辉等从不同环境中分离出38株贫营养微生物，经16srDNA序列分析，主要为不动杆菌属(Acinetobacter)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)和短杆菌属(Brevibacterium)等18个属，其中短小芽孢杆菌(Baci-lluspumilus)菌株对水体CODMn和TOC的降解率分别为48.01%和46.83%[1]；北京师范大学环境学院的全向春、岑艳等从城市污水处理厂活性污泥中筛选得到2株好氧反硝化微生物，在贫营养条件下的生物膜系统中投加两种微生物后，对TN去除率分别达到68%和64%，比对照系统分别高47%和43%，且NH4+-N去除率均接近100%；西安建筑科技大学环境与市政工程学院的黄延林、刘婷婷、张海涵等经过从水源水库沉积物中分离得到234株贫营养好氧反硝化微生物，并对其脱氮特性和高效菌株对水体功能微生物种群的调控机制进行探索，结果表明，膜在贫营养条件下的反硝化能力，并且不会抑制生物膜硝化能力，可实现生物膜系统同步硝化反硝化。
国外已有利用分子生物学的方法，从大分子合成、基因表达和调控等多方面深入研究贫营养细菌的生理机制[2]。如用放射性标记与聚丙烯酰胺凝胶电泳技术相结合研究贫营养细菌对饥饿的生理反应，利用双向电泳法识别参与饥饿生理反应的基因等等。这方面的研究将为贫营养细菌应用于解决越来越严峻的水污染问题产生较大的推动作用[3]。许多研究显示，环境中的贫营养细菌有一部分是专性贫营养型的，但是大部分是属于兼性富营养类型，后者除了能在贫营养环境中生存，还可以在有丰富有机营养的环境中生存繁殖。
1.2.2 微胶囊技术的发展
微胶囊技术是以天然或合成的高分子材料作为囊壁，通过化学法、物理法或物理化学法将固体或液体材料包囊成直径为1—5000um的微小囊状物的技术称为微胶囊技术。其优势在于形成微胶囊时，囊心被包覆而与外界环境隔离，它的性质能毫无影响的被保留下来，微囊的囊膜具有透膜或半透膜的特性，因此其所包含的囊心物质可借压力、pH值、酶、温度或提取等方法完全释放出来[4]。
从20世纪80年代开始就有研究者进行微生物细菌微胶囊的探索，研究较多的有食品益生菌—双歧杆菌、乳酸菌等，生物农药细菌—苏云金杆菌、白僵菌等。由于该技术具有很高的经济价值，多数研究结果已申请了专利。目前，国内外已经有多种微胶囊化技术应用在微生物领域。
国外利用锐孔—凝固浴法微胶囊化益生菌，最早主要是海藻酸钙的单层包埋，后来逐渐发展成为多层包埋。早在1985年日本丸山哲彦等的专利中将双歧杆菌菌液及淀粉等保护剂与海藻酸钠混合，通过喷嘴喷入CaC12固化液中，干燥后再用融点高于体温的油脂喷涂于颗料表面，制得的产品室温保存6个月后存活率在50%以上。由于只是海藻酸钙的单层包埋，因此抗胃酸以及肠溶性有限。随后，在他们第二年申请的另一份专利中，将双歧杆菌菌粉与淀粉混合后悬浮于熔点在30—45°C的硬化油中作为芯材，一定比例的明胶与果胶作为被膜液，用二重管喷嘴(外管被膜液、内管芯材溶液)，滴入冷却油的软胶囊后，再浸渍于5%的Ca盐中，进行肠溶性处理,取出后冷风干燥，产品室温下6个月后存活率也大于50%，并能通过肠溶性崩解实验。虽然，在这一专利中，硬化油与菌粉一道作为芯材通过内管被包埋，但由于成型前菌粉是均匀混悬在熔化的硬化油中，在凝固后菌粉实际上被均匀固定在硬化油形成微球内，因此硬化油实际上也起到了作为壁材的作用。1988年，日本学者藤原正弘等的专利则将双歧杆菌的活菌液与添加了疏水性乳化剂的油脂混合形成包含活菌的W/O型乳状液，然后将制得的乳状液分散于多价金属盐溶液中，形成W/0/W型双重乳状液，最后将其通过喷嘴逐滴滴入成膜剂中，制备得到具有两层包埋的微型胶囊产品，在pH4.0以下的溶液中保存21天，仍有1%以上双歧杆菌存活[8]。欧洲1994年的一份专利中采用了三层挤压法，双歧杆菌菌粉悬浮于室温下不流动的疏水物质中作为芯材，壁材为：(l)熔点高于体温的油脂；(2)一定比例的明胶和果胶，芯材和壁材分别进入一三层同心喷嘴的内、中、外层，然后同时滴入冷却油凝固成型，从而得到了内层为固态油脂，外层为明胶和果胶膜的双层包埋微胶囊[6] 。
Kim等将菌体浓缩液或经冷冻干燥后的干菌粉通过挤压制成球状干颗粒，在流化床上用肠溶性材料(海藻酸钠等)喷雾涂膜，产品室温贮藏时涂膜的比未涂膜的存活率高40倍，在低pH下贮藏时涂膜的存活率也较高。杨汝德等将三种双歧杆菌、高效活菌保护剂和双歧促生因子一起作为核心物质，采用流化床包膜法制备得到耐酸肠溶微囊益生菌。微囊在人工模拟胃液(PHl.5一2.0)中处理4h，其中的双歧杆菌活菌数仍保持在44%以上；在人工肠液中处理15min，微囊全部崩解释放出活性菌；在37°C下保存3个月(相当于常温下一年)，其中的活菌数仍大于109个/g。横田丰一等采用此法将双歧杆菌菌粉分散于融点高于体温的硬化油中，搅拌均匀后喷雾，得粒径40一60um的微胶囊，产品在胃液(pH3.0)中存活率达到90%以上[7]。在丸山哲彦和秋原义郎的专利中，他们以双歧杆菌冻干粉和棕搁油的混悬液为芯材，将其分散于40°C的10%明胶溶液中，然后迅速倒入5°C的色拉油中，快速搅拌，冷却固化即可得到明胶凝胶包埋住的双歧杆菌,进一步甲醛固化、干燥，就得到干燥的微胶囊[8]。
1 绪论 1
1.1 研究背景 1
1.2国内外研究进展情况 1
1.2.1 贫营养微生物研究发展 1
1.2.2微胶囊技术的发展 2
1.3本课题研究的意义 4
2 实验材料和实验方法 5
2.1 实验主要仪器 5
2.2 实验主要试剂 6
2.3 实验方法 6
3 实验结果与讨论. 12
3.1 贫营养细菌培养 12
3.2 乳化法制备微胶囊. 14
3.3 净水实验 23
结论 28
致谢 29
参考文献 30
1 绪论
1.1 研究背景
微污染水体是指随着国民经济的日益发展，我国饮用水水源的微污染问题日益严峻，常规的混凝过滤净水工艺难以保障水质达标。当前，筛选高效贫营养微生物对饮用水进行深度处理已成为净水工艺研究领域的重要分支。优良的贫营养细菌可以和常规净水菌剂形成一个完整的净水体系，把污染降低到更低的水平。由于单一贫营养微生物的净化效果很难满足水体净化的各方面的需求，将鉴定出的高效贫营养微生物进行复配，研发贫营养微生物制剂，具有重要而迫切的现实意义。菌剂活性的高低对使用效果的好坏有至关重要的影响，而制备方法又是其活性的决定因素。传统的“载体+抑制剂”的储存方法，无法有效保持第一代菌种活性，因此使用时的品质无法有效保障，且保质期较短。微胶囊封装技术能有效抑制微生物的代谢作用：微胶囊封装技术的封闭层使微生物处于休眠状态，不受温度、湿度、氧化等外部因素影响；溶于水后，其保护层可被迅速溶解，从而保证高剂量的第一代菌株投入工作。因此对采用微胶囊封装技术制备微生物菌剂，在较长的保质 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
期内保持菌剂的高活性的研究具有深远意义。
1.2 国内外研究进展情况
1.2.1 贫营养微生物研究发展
在贫营养净水微生物的分离提纯方面国内学者取得了较多的研究成果，如华中科技大学的夏辉等从不同环境中分离出38株贫营养微生物，经16srDNA序列分析，主要为不动杆菌属(Acinetobacter)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)和短杆菌属(Brevibacterium)等18个属，其中短小芽孢杆菌(Baci-lluspumilus)菌株对水体CODMn和TOC的降解率分别为48.01%和46.83%[1]；北京师范大学环境学院的全向春、岑艳等从城市污水处理厂活性污泥中筛选得到2株好氧反硝化微生物，在贫营养条件下的生物膜系统中投加两种微生物后，对TN去除率分别达到68%和64%，比对照系统分别高47%和43%，且NH4+-N去除率均接近100%；西安建筑科技大学环境与市政工程学院的黄延林、刘婷婷、张海涵等经过从水源水库沉积物中分离得到234株贫营养好氧反硝化微生物，并对其脱氮特性和高效菌株对水体功能微生物种群的调控机制进行探索，结果表明，膜在贫营养条件下的反硝化能力，并且不会抑制生物膜硝化能力，可实现生物膜系统同步硝化反硝化。
国外已有利用分子生物学的方法，从大分子合成、基因表达和调控等多方面深入研究贫营养细菌的生理机制[2]。如用放射性标记与聚丙烯酰胺凝胶电泳技术相结合研究贫营养细菌对饥饿的生理反应，利用双向电泳法识别参与饥饿生理反应的基因等等。这方面的研究将为贫营养细菌应用于解决越来越严峻的水污染问题产生较大的推动作用[3]。许多研究显示，环境中的贫营养细菌有一部分是专性贫营养型的，但是大部分是属于兼性富营养类型，后者除了能在贫营养环境中生存，还可以在有丰富有机营养的环境中生存繁殖。
1.2.2 微胶囊技术的发展
微胶囊技术是以天然或合成的高分子材料作为囊壁，通过化学法、物理法或物理化学法将固体或液体材料包囊成直径为1—5000um的微小囊状物的技术称为微胶囊技术。其优势在于形成微胶囊时，囊心被包覆而与外界环境隔离，它的性质能毫无影响的被保留下来，微囊的囊膜具有透膜或半透膜的特性，因此其所包含的囊心物质可借压力、pH值、酶、温度或提取等方法完全释放出来[4]。
从20世纪80年代开始就有研究者进行微生物细菌微胶囊的探索，研究较多的有食品益生菌—双歧杆菌、乳酸菌等，生物农药细菌—苏云金杆菌、白僵菌等。由于该技术具有很高的经济价值，多数研究结果已申请了专利。目前，国内外已经有多种微胶囊化技术应用在微生物领域。
国外利用锐孔—凝固浴法微胶囊化益生菌，最早主要是海藻酸钙的单层包埋，后来逐渐发展成为多层包埋。早在1985年日本丸山哲彦等的专利中将双歧杆菌菌液及淀粉等保护剂与海藻酸钠混合，通过喷嘴喷入CaC12固化液中，干燥后再用融点高于体温的油脂喷涂于颗料表面，制得的产品室温保存6个月后存活率在50%以上。由于只是海藻酸钙的单层包埋，因此抗胃酸以及肠溶性有限。随后，在他们第二年申请的另一份专利中，将双歧杆菌菌粉与淀粉混合后悬浮于熔点在30—45°C的硬化油中作为芯材，一定比例的明胶与果胶作为被膜液，用二重管喷嘴(外管被膜液、内管芯材溶液)，滴入冷却油的软胶囊后，再浸渍于5%的Ca盐中，进行肠溶性处理,取出后冷风干燥，产品室温下6个月后存活率也大于50%，并能通过肠溶性崩解实验。虽然，在这一专利中，硬化油与菌粉一道作为芯材通过内管被包埋，但由于成型前菌粉是均匀混悬在熔化的硬化油中，在凝固后菌粉实际上被均匀固定在硬化油形成微球内，因此硬化油实际上也起到了作为壁材的作用。1988年，日本学者藤原正弘等的专利则将双歧杆菌的活菌液与添加了疏水性乳化剂的油脂混合形成包含活菌的W/O型乳状液，然后将制得的乳状液分散于多价金属盐溶液中，形成W/0/W型双重乳状液，最后将其通过喷嘴逐滴滴入成膜剂中，制备得到具有两层包埋的微型胶囊产品，在pH4.0以下的溶液中保存21天，仍有1%以上双歧杆菌存活[8]。欧洲1994年的一份专利中采用了三层挤压法，双歧杆菌菌粉悬浮于室温下不流动的疏水物质中作为芯材，壁材为：(l)熔点高于体温的油脂；(2)一定比例的明胶和果胶，芯材和壁材分别进入一三层同心喷嘴的内、中、外层，然后同时滴入冷却油凝固成型，从而得到了内层为固态油脂，外层为明胶和果胶膜的双层包埋微胶囊[6] 。
Kim等将菌体浓缩液或经冷冻干燥后的干菌粉通过挤压制成球状干颗粒，在流化床上用肠溶性材料(海藻酸钠等)喷雾涂膜，产品室温贮藏时涂膜的比未涂膜的存活率高40倍，在低pH下贮藏时涂膜的存活率也较高。杨汝德等将三种双歧杆菌、高效活菌保护剂和双歧促生因子一起作为核心物质，采用流化床包膜法制备得到耐酸肠溶微囊益生菌。微囊在人工模拟胃液(PHl.5一2.0)中处理4h，其中的双歧杆菌活菌数仍保持在44%以上；在人工肠液中处理15min，微囊全部崩解释放出活性菌；在37°C下保存3个月(相当于常温下一年)，其中的活菌数仍大于109个/g。横田丰一等采用此法将双歧杆菌菌粉分散于融点高于体温的硬化油中，搅拌均匀后喷雾，得粒径40一60um的微胶囊，产品在胃液(pH3.0)中存活率达到90%以上[7]。在丸山哲彦和秋原义郎的专利中，他们以双歧杆菌冻干粉和棕搁油的混悬液为芯材，将其分散于40°C的10%明胶溶液中，然后迅速倒入5°C的色拉油中，快速搅拌，冷却固化即可得到明胶凝胶包埋住的双歧杆菌,进一步甲醛固化、干燥，就得到干燥的微胶囊[8]。
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