响应面法优化淡菜多糖提取工艺研究
目 录
1 引言 1
1.1 研究背景和意义 1
1.2 多糖的提取方法 1
1.3 总糖的测定 2
1.4 响应面法 3
2 实验部分 4
2.1 材料、试剂及仪器 4
2.2 实验原理 5
2.3 实验方法 5
3 结果与讨论 7
3.1 淡菜多糖标准曲线的绘制 7
3.2 单因素实验结果 7
3.3 响应面优化试验结果 9
3.4 验证试验 14
结 论 15
致 谢 16
参 考 文 献 17
1 引言
1.1 研究背景和意义
1.1.1 研究背景
淡菜又被称为“东海夫人”，是中外闻名的海产品。淡菜属于海产双壳贝类贻贝的一种干制品，有很高的药用价值及食疗价值。据《本草纲目》记载，虚痨、经血衰少、吐血久痢、肠鸣腰痛等疾病，淡菜贻贝均能治疗。淡菜还可用作妇女产后滋补。
多糖具有许多生理活性，是组成生命的四大物质之一。多糖的研究虽然与核酸、蛋白质、脂类相比，起步比较晚，但是仍然引发了各地学者的兴趣和激烈的讨论。近年来，此类研究甚多且这些研究表明多糖有诸多疗效。如抗动脉粥样硬化和降低血脂活性，抑制血小板聚集，改善心肌氧的供应和营养物质的供应及抗心肌缺血，还能改善微循环降血压[1-6]，还有抗肿瘤作用[7]等。
1.1.2 研究的目的及意义
植物多糖具有多种生物活性并且可以治疗某些疾病，已广泛应用于临床。贝类多糖的毒副作用小且具有诸多疗效，可以为人类的医疗事业做出巨大的贡献。但由于技术不过关、研究不够深入等种种原因，贝类多糖的提取工艺、分离纯化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
工艺、药理和临床试验等方面的研究和探索还未完善，所以未能开发成药物。此外，我国贝类产量十分丰富且价格低廉。我国沿海地区如山东、浙江、广东等有大面积的养殖区域，产量很大。因此淡菜多糖很有研究价值，并且研究前景非常广阔。
1.2 多糖的提取方法
1.2.1 水提法
其原理是利用多糖微溶热水而不溶于乙醇的特性，用热水提出多糖并将其提取液浓缩，然后在提取液中加入适当的乙醇并反复数次沉降，烘干得到粗多糖。徐琴等[8]以淮山药多糖的总糖含量为指标，采用正交实验的方法，对提取温度、提取时间、水料比进行优化，确定最佳提取工艺。白红进等[9]用水提法对黑果枸杞多糖进行提取，所得提取率为9.64%，虽然低于超声-微波协同萃取法，但是比超声波提取法和微波提取法高。聂凌鸿等[10]使用热水浸提广东淮山水溶性多糖，用响应面积法优化提取时间、温度、水料比，得到最佳工艺。在最优工艺的条件下进行试验，所得多糖提取率为0.2816%。
水提法的影响因素包括提取温度、提取时间、水料比、提取物的性质（如颗粒的大小）、搅拌的速率等。水法提取虽然提取率不一定最高，但是对它设备要求不高。另外水提法对溶剂的要求不高且来源广泛，成本低，便于推广，操作方便，准确度高。由于多糖在热水中稳定，所以用水提法提取对多糖破坏比较小，是一个值得选择的好方法。
1.2.2 超临界流体萃取法
在超临界状态下，超临界流体与目标物接触，使目标物依次把极性、沸点和分子量大小不同的成分萃取出来，当恢复到常压常温时，溶解在流体中的成分立即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开，从而达到萃取目的[11]。如，廖周坤等[12]采用超临界流体萃取，选择CO2作为流体，与传统的溶剂提取（如水提法、碱提法）相比，运用此法得到的藏药—雪灵芝多糖提取率提高了1.62倍。
影响超临界流体萃取效果的主要因素有：萃取条件，如压力、温度、时间、溶剂和流量，原料的性质，例如颗粒的大小等。超临界流体萃取技术提取能力强、效率高、无溶剂残留、提取物纯度高、很少损失易挥发成分或破坏活性物质。然而因成本高，不易实现，所以本实验并未采用超临界流体萃取的方法。
1.2.3 酶提法
酶法是通过酶反应将原料组织分解，加速有效成分的释放和提取，选择适宜条件将杂质去除，促进某些极性低的脂溶性成分转化成糖苷类易溶于水的成分，降低提取的难度。OurdiaBouzid 等[13]用酶法提取橄榄油中的酚类化合物，以酶水解酚类化合物和多糖之间的酯键。结果显示，与传统提取方法相比，酶法能够在较低的温度和较短的时间达到相同的结果。Hauke Hilz 等[14]应用酶提法提取果胶多糖，实验数据表明提取率显著提高。
影响酶法提取的因素有酶的浓度、酶的用量、酶的比例、温度、pH值、抑制剂、激活剂等。酶法提取条件较为温和、易于除去杂质、回收率较高且能耗低。鉴于酶的专一性和选择性，提取时多采用复合酶。然而由于酶的价格比较高且精制过程工作量大，酶法的应用受到一定程度的限制，因而本实验没有采用酶法。1.3 总糖的测定
1.3.1 蒽酮硫酸法
在浓硫酸的作用下，糖可通过脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物。在630 nm处比色，生成物颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
量[15]。试剂包括0.2%蒽酮试剂、0.1%葡萄糖溶液。
蒽酮硫酸法的特点是几乎能够测定所有的碳水化合物，并且此法灵敏度较高。当被测物含量在20-200 mg/L范围内时，准确度比较高。糖的种类不同时，与蒽酮试剂反应生成的颜色深浅也不同。测定不同糖的混合物时，会因混合物中糖的比例不同造成误差。测定单一糖类时，不会出现上述误差。此法需要检测液澄清，使得操作复杂化，应用受到限制，本实验并未采用此方法。
1.3.2 斐林试剂法
斐林试剂是由0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和0.05 g/mL的硫酸铜溶液配制而成的，其本质是新配制的氢氧化铜。在加热时，它与可溶性的还原性糖(葡萄糖、果糖和麦芽糖)生成砖红色的氧化铜沉淀。加糖使斐林试剂完全还原，根据所用糖量，计算出样品中总糖的含量[16]。
测定还原糖时，斐林试剂需要现配现用。此法中，颜色变化为浅蓝色→棕色→砖红色，需要肉眼观察反应的终点，有一定的误差。操作相对来说较为繁琐，所以本实验没有选择此方法。
1.3.3 苯酚硫酸法
在硫酸的作用下，多糖水解成单糖并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，且在一定浓度范围内颜色深浅与糖含量成正比，用比色法测定糖含量[17]。试剂包括5%的苯酚、浓硫酸，其中5%的苯酚需要现配现用。
如果提取液中要较多的可溶性蛋白，必须先除去蛋白质，否则会影响试验的准确度。去除蛋白质的方法包括溶剂沉淀法、中性盐析法、强酸沉淀法、热凝固法、蛋白酶处理等。如3%三氯乙酸法，其原理是当溶液低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与酸根离子形成不溶性沉淀，从而将蛋白质与目标物分离。
苯酚硫酸法简单、快速，灵敏度高，重复性好，是测定多糖含量的好方法。1.4 响应面法
随着科学技术的发展，生产和生活中运用到的模型越来越复杂，经常呈非光滑或者非线性，以往的函数或优化方法难以满足工程的需要。后来诞生了渐进似的优化方法，即响应面法。
响应面法（Response Surface Methodology，简称：RSM）是一种统计方法。如果变量（包括水料比、提取温度、提取时间、pH值等）比较多，首先要进行筛选试验。即通过分式析因设计、Plackett-Burman设计以及非正规正交表等排除对实验结果无影响或影响较小的变量。如果变量少，直接进行以下的研究。下面的研究分为两个阶段。第一阶段是确定经过筛选的变量的水平是否接近最优值。如果远离最优值，则使用一阶模型，进行正交的一阶设计。当变量水平接近最优区域时，则可进行第二阶段。这个阶段的目的是在最优值附近的小范围内细化工艺，并找出最优条件。本实验依据Box-Behnken的中心组合设计，按照设计顺序进行实验，分析数据，而后确定最佳工艺和最佳响应值[18]。
1 引言 1
1.1 研究背景和意义 1
1.2 多糖的提取方法 1
1.3 总糖的测定 2
1.4 响应面法 3
2 实验部分 4
2.1 材料、试剂及仪器 4
2.2 实验原理 5
2.3 实验方法 5
3 结果与讨论 7
3.1 淡菜多糖标准曲线的绘制 7
3.2 单因素实验结果 7
3.3 响应面优化试验结果 9
3.4 验证试验 14
结 论 15
致 谢 16
参 考 文 献 17
1 引言
1.1 研究背景和意义
1.1.1 研究背景
淡菜又被称为“东海夫人”，是中外闻名的海产品。淡菜属于海产双壳贝类贻贝的一种干制品，有很高的药用价值及食疗价值。据《本草纲目》记载，虚痨、经血衰少、吐血久痢、肠鸣腰痛等疾病，淡菜贻贝均能治疗。淡菜还可用作妇女产后滋补。
多糖具有许多生理活性，是组成生命的四大物质之一。多糖的研究虽然与核酸、蛋白质、脂类相比，起步比较晚，但是仍然引发了各地学者的兴趣和激烈的讨论。近年来，此类研究甚多且这些研究表明多糖有诸多疗效。如抗动脉粥样硬化和降低血脂活性，抑制血小板聚集，改善心肌氧的供应和营养物质的供应及抗心肌缺血，还能改善微循环降血压[1-6]，还有抗肿瘤作用[7]等。
1.1.2 研究的目的及意义
植物多糖具有多种生物活性并且可以治疗某些疾病，已广泛应用于临床。贝类多糖的毒副作用小且具有诸多疗效，可以为人类的医疗事业做出巨大的贡献。但由于技术不过关、研究不够深入等种种原因，贝类多糖的提取工艺、分离纯化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
工艺、药理和临床试验等方面的研究和探索还未完善，所以未能开发成药物。此外，我国贝类产量十分丰富且价格低廉。我国沿海地区如山东、浙江、广东等有大面积的养殖区域，产量很大。因此淡菜多糖很有研究价值，并且研究前景非常广阔。
1.2 多糖的提取方法
1.2.1 水提法
其原理是利用多糖微溶热水而不溶于乙醇的特性，用热水提出多糖并将其提取液浓缩，然后在提取液中加入适当的乙醇并反复数次沉降，烘干得到粗多糖。徐琴等[8]以淮山药多糖的总糖含量为指标，采用正交实验的方法，对提取温度、提取时间、水料比进行优化，确定最佳提取工艺。白红进等[9]用水提法对黑果枸杞多糖进行提取，所得提取率为9.64%，虽然低于超声-微波协同萃取法，但是比超声波提取法和微波提取法高。聂凌鸿等[10]使用热水浸提广东淮山水溶性多糖，用响应面积法优化提取时间、温度、水料比，得到最佳工艺。在最优工艺的条件下进行试验，所得多糖提取率为0.2816%。
水提法的影响因素包括提取温度、提取时间、水料比、提取物的性质（如颗粒的大小）、搅拌的速率等。水法提取虽然提取率不一定最高，但是对它设备要求不高。另外水提法对溶剂的要求不高且来源广泛，成本低，便于推广，操作方便，准确度高。由于多糖在热水中稳定，所以用水提法提取对多糖破坏比较小，是一个值得选择的好方法。
1.2.2 超临界流体萃取法
在超临界状态下，超临界流体与目标物接触，使目标物依次把极性、沸点和分子量大小不同的成分萃取出来，当恢复到常压常温时，溶解在流体中的成分立即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开，从而达到萃取目的[11]。如，廖周坤等[12]采用超临界流体萃取，选择CO2作为流体，与传统的溶剂提取（如水提法、碱提法）相比，运用此法得到的藏药—雪灵芝多糖提取率提高了1.62倍。
影响超临界流体萃取效果的主要因素有：萃取条件，如压力、温度、时间、溶剂和流量，原料的性质，例如颗粒的大小等。超临界流体萃取技术提取能力强、效率高、无溶剂残留、提取物纯度高、很少损失易挥发成分或破坏活性物质。然而因成本高，不易实现，所以本实验并未采用超临界流体萃取的方法。
1.2.3 酶提法
酶法是通过酶反应将原料组织分解，加速有效成分的释放和提取，选择适宜条件将杂质去除，促进某些极性低的脂溶性成分转化成糖苷类易溶于水的成分，降低提取的难度。OurdiaBouzid 等[13]用酶法提取橄榄油中的酚类化合物，以酶水解酚类化合物和多糖之间的酯键。结果显示，与传统提取方法相比，酶法能够在较低的温度和较短的时间达到相同的结果。Hauke Hilz 等[14]应用酶提法提取果胶多糖，实验数据表明提取率显著提高。
影响酶法提取的因素有酶的浓度、酶的用量、酶的比例、温度、pH值、抑制剂、激活剂等。酶法提取条件较为温和、易于除去杂质、回收率较高且能耗低。鉴于酶的专一性和选择性，提取时多采用复合酶。然而由于酶的价格比较高且精制过程工作量大，酶法的应用受到一定程度的限制，因而本实验没有采用酶法。1.3 总糖的测定
1.3.1 蒽酮硫酸法
在浓硫酸的作用下，糖可通过脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物。在630 nm处比色，生成物颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
量[15]。试剂包括0.2%蒽酮试剂、0.1%葡萄糖溶液。
蒽酮硫酸法的特点是几乎能够测定所有的碳水化合物，并且此法灵敏度较高。当被测物含量在20-200 mg/L范围内时，准确度比较高。糖的种类不同时，与蒽酮试剂反应生成的颜色深浅也不同。测定不同糖的混合物时，会因混合物中糖的比例不同造成误差。测定单一糖类时，不会出现上述误差。此法需要检测液澄清，使得操作复杂化，应用受到限制，本实验并未采用此方法。
1.3.2 斐林试剂法
斐林试剂是由0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和0.05 g/mL的硫酸铜溶液配制而成的，其本质是新配制的氢氧化铜。在加热时，它与可溶性的还原性糖(葡萄糖、果糖和麦芽糖)生成砖红色的氧化铜沉淀。加糖使斐林试剂完全还原，根据所用糖量，计算出样品中总糖的含量[16]。
测定还原糖时，斐林试剂需要现配现用。此法中，颜色变化为浅蓝色→棕色→砖红色，需要肉眼观察反应的终点，有一定的误差。操作相对来说较为繁琐，所以本实验没有选择此方法。
1.3.3 苯酚硫酸法
在硫酸的作用下，多糖水解成单糖并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，且在一定浓度范围内颜色深浅与糖含量成正比，用比色法测定糖含量[17]。试剂包括5%的苯酚、浓硫酸，其中5%的苯酚需要现配现用。
如果提取液中要较多的可溶性蛋白，必须先除去蛋白质，否则会影响试验的准确度。去除蛋白质的方法包括溶剂沉淀法、中性盐析法、强酸沉淀法、热凝固法、蛋白酶处理等。如3%三氯乙酸法，其原理是当溶液低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，可与酸根离子形成不溶性沉淀，从而将蛋白质与目标物分离。
苯酚硫酸法简单、快速，灵敏度高，重复性好，是测定多糖含量的好方法。1.4 响应面法
随着科学技术的发展，生产和生活中运用到的模型越来越复杂，经常呈非光滑或者非线性，以往的函数或优化方法难以满足工程的需要。后来诞生了渐进似的优化方法，即响应面法。
响应面法（Response Surface Methodology，简称：RSM）是一种统计方法。如果变量（包括水料比、提取温度、提取时间、pH值等）比较多，首先要进行筛选试验。即通过分式析因设计、Plackett-Burman设计以及非正规正交表等排除对实验结果无影响或影响较小的变量。如果变量少，直接进行以下的研究。下面的研究分为两个阶段。第一阶段是确定经过筛选的变量的水平是否接近最优值。如果远离最优值，则使用一阶模型，进行正交的一阶设计。当变量水平接近最优区域时，则可进行第二阶段。这个阶段的目的是在最优值附近的小范围内细化工艺，并找出最优条件。本实验依据Box-Behnken的中心组合设计，按照设计顺序进行实验，分析数据，而后确定最佳工艺和最佳响应值[18]。
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