响应面优化河蚬多糖的提取及纯化
河蚬多糖是一个具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗衰老、清热利胆等生物活性的天然高分子多聚物，具有养好的保健作用。本实验以冷冻河蚬肉为原料，采用单因素及响应面实验对水提法工艺进行优化，得到最佳工艺为：提取时间为8 h，温度为97℃，固液比为1:30，提取3次。对醇沉工艺考察，结果为80%乙醇溶液最佳。在此最优条件下，多糖得率4.98%，与预测值非常接近。关键词 河蚬多糖，提取工艺，响应面目 录
1 引言 1
1.1 动物多糖的生物活性 1
1.2 多糖的提取方法 2
1.3 多糖的含量测定方法 3
1.4 粗多糖的除蛋白 4
1.5 多糖的纯化 4
1.6 多糖纯度鉴定 6
1.7 河蚬多糖的营养功能研究 7
1.8 河蚬多糖发展存在的问题 7
2 实验材料与方法 8
2.1 材料 8
2.2 试剂与仪器 8
2.3 实验方法 9
3结果与讨论 11
3.1 葡萄糖标准曲线 11
3.2 液固比对提取率的影响 12
3.3 提取时间对提取率的影响 13
3.4 提取温度对提取率的影响 13
3.5 确定最佳提取方案 14
3.6 响应面实验 14
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
河蚬生物活性多糖中含有大量的粗蛋白质、丰富的碳水化合物和B族维生素，维生素C、E及铁等多种微量营养素，具有清热解毒、凉血通淋以及降血脂、利尿、抑菌、抗肿瘤之功效 。河蚬具有很高的食用价值和保健作用。河蚬作为中药的药材，具有 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰、解酒等功效。目前对河蚬功能成份的研究主要集中在蛋白和脂类物质方面，对多糖的研究还较少，而且不够深入。本课题的主要目的便是对河蚬多糖的提取的最优化条件进行确定，同时粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素等杂质，必须分别除去。
苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法是实验中最常使用的两种多糖的检测手法，这两种方法都比较的快速、简便。提取方法较多，一般有碱提取法、酸提取法、水提取法、超声波提取法、微波提取法、酶解提取法、超滤提取法和超临界萃取法等等，但我们最常使用的还是水提取法，水提取法在提取多糖上是一种比较传统的方法。
1.1 动物多糖的生物活性
1.1.1 抗肿瘤、提高免疫力
动物多糖具有抗肿瘤、提高免疫力作用。研究表明，玉足海参多糖[1]对实验小鼠乳腺癌、肺癌、黑色素瘤均具有显著的生长抑制率。多糖抗癌的原因大多是激活了体内免疫系统，改善了机体免疫力。从皱纹盘鲍中提取的鲍鱼多糖能够明显增加巨噬细胞吞噬能力，增强迟发超敏反应。这种免疫增强作用可能是其抗肿瘤作用的机理。此外还发现三角帆蚌多糖[2]、文蛤多糖、鹿茸多糖、蚕蛹多糖、泥鳅多糖、乌贼墨、鳖鱼软骨素、海参等具有抗肿瘤和增强免疫力的活性。多糖应用于肿瘤治疗将是一个新的迷人的领域。
1.1.2 抗凝血、抗血栓
从动物材料中提取的肝素、低分子肝素等小分子多糖和其他一些酸性粘多糖能够抑制凝血蛋白酶原转变成凝血酶，具有抗凝血作用。刺参酸性粘多糖[3]能够抑制纤维蛋白单体的聚集，机理是提高纤溶活性，增加纤溶敏感性，改变凝胶结构以促进纤溶和直接降解纤维蛋白。从中国林蛙头分离的林蛙多糖[4]具有抗凝血活性，但它的抗凝活性要比肝素小得多。考虑到肝素在临床上有出血的倾向和动物多糖类物质的多种生物活性，抗凝作用小得林蛙多糖有更广阔的药用和食用价值。玉足海参[5]中提取的酸性粘多糖已研制成玉足海参胶囊，具有抗凝和降低血粘的功效。
1.1.3 降血糖、降血脂
泥鳅多糖MAP具有降血糖和调节血脂的作用[6],实验证明，MAP能明显降低链佐星或四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖升高；同时，MAP还能明显降低链佐星或四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血清中的总胆固醇、甘油三酷和低密度脂蛋白胆固醇升高。此外鳖鱼软骨酸性多糖也具有一定的降血脂的作用，机理可能与其提高毛细血管内脂蛋白脂酶活性并促进该酶释放有关。
1.1.4 抗氧化、抗衰老
泥鳅多糖[7]具有清除活性氧的作用和对OH导致DNA链损伤的抑制作用。实验表明泥鳅多糖能够有效地清除O2、0H、H20等活性氧，对DNA链具有良好的保护作用。从猪十二指肠粘膜中提取的中性复合粘多糖具有减轻脑缺血再灌注损伤的作用，体外实验证明它有抗氧化作用[8]。
1.1.5 抗炎、抗疲劳
泥鳅多糖的抗炎效果与地塞米松无显著差异，甚至有的作用还略强于地塞米松磷酸钠注射液，并且呈一定的量效关系。近年来已证实具有抗疲劳作用的动物多糖有：中华鳖多糖、壳聚糖[9]。研究表明，壳聚糖具有极显著的抗疲劳活性，壳聚糖能显著延长小白鼠负重游泳时间，能有效减轻运动机体中乳酸的堆积并能迅速消除堆积的乳酸，增强有氧代谢耐力，提高小白鼠机体运动能力，从而延缓小鼠机体疲劳的发生并加速疲劳的恢复。
1.2 多糖的提取方法
1.2.1 水提取法
水煎煮法是多糖提取的传统方法，是用水作为溶剂煎煮提取多糖。因为多糖在冷水中溶解度较低，一般要在70-90℃热水中回流提取2～3ｈ，将提取液真空浓缩后加入乙醇将多糖析出。目前多数国内文献采用水煎煮法提取多糖，如盛家荣等采用此法从板蓝根中提取多糖，李志洲等[10]采用该法提取大枣多糖。该法具有设备简单、操作方便、适用面广等优点。但是这种方法也存在操作时间长，收率低，并需多次反复操作，能耗较高等缺点。黄琳娟等[11]人研究枸杞多糖时，采用水提法先浸泡24h，过滤后残渣再用水浸泡6h，操作周期过长。
1.2.2 碱提法
含有糠醛酸的多糖及酸性多糖适合用碱提法提取，其原理是动物细胞在碱液中会吸水溶胀以至于破裂，使细胞中多糖释放并溶解在稀碱溶液中，使其提取率大大提高。常用的碱液有氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠。但有些多糖在碱性较强的环境下会水解，为了防止多糖降解，通常通入氮气或加入硼氢化钠（钾）来保护多糖。碱提法提取多糖的主要影响因素是碱的浓度、提取温度、及提取时间。
碱提取法只在一些特定的多糖提取中占有优势，而且在碱提中，碱的浓度应该得到有效的控制，另外，稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩，然后醇沉，获得多糖沉淀。
在对粗多糖进行完脱蛋白的过程之后，要想得到纯度更高的多糖，更重要的是多糖的分离纯化工艺。纯化的目的是将粗多糖的杂质去除而得到单一的多糖组分，目前已经被报道出来的纯化方法有以下几种：
1.5.1 分级沉淀法
分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加入与该溶液能互溶的溶剂，通过改变溶剂的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。分级沉淀是用不同浓度的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等来分级沉淀纯化多糖，一般采用乙醇作为溶剂的较多。如在粗多糖的水溶液中，分次加入乙醇使含醇量逐步增加，使得粗多糖通过不同的乙醇体积分数得到不同的组分。采用乙醇分级沉淀法提取的香菇多糖中，结果表明，当乙醇体积为30%-50%时，得到的多糖含量最高。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。
1 引言 1
1.1 动物多糖的生物活性 1
1.2 多糖的提取方法 2
1.3 多糖的含量测定方法 3
1.4 粗多糖的除蛋白 4
1.5 多糖的纯化 4
1.6 多糖纯度鉴定 6
1.7 河蚬多糖的营养功能研究 7
1.8 河蚬多糖发展存在的问题 7
2 实验材料与方法 8
2.1 材料 8
2.2 试剂与仪器 8
2.3 实验方法 9
3结果与讨论 11
3.1 葡萄糖标准曲线 11
3.2 液固比对提取率的影响 12
3.3 提取时间对提取率的影响 13
3.4 提取温度对提取率的影响 13
3.5 确定最佳提取方案 14
3.6 响应面实验 14
结论 19
致谢 20
参考文献 21
1 引言
河蚬生物活性多糖中含有大量的粗蛋白质、丰富的碳水化合物和B族维生素，维生素C、E及铁等多种微量营养素，具有清热解毒、凉血通淋以及降血脂、利尿、抑菌、抗肿瘤之功效 。河蚬具有很高的食用价值和保健作用。河蚬作为中药的药材，具有 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰、解酒等功效。目前对河蚬功能成份的研究主要集中在蛋白和脂类物质方面，对多糖的研究还较少，而且不够深入。本课题的主要目的便是对河蚬多糖的提取的最优化条件进行确定，同时粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素等杂质，必须分别除去。
苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法是实验中最常使用的两种多糖的检测手法，这两种方法都比较的快速、简便。提取方法较多，一般有碱提取法、酸提取法、水提取法、超声波提取法、微波提取法、酶解提取法、超滤提取法和超临界萃取法等等，但我们最常使用的还是水提取法，水提取法在提取多糖上是一种比较传统的方法。
1.1 动物多糖的生物活性
1.1.1 抗肿瘤、提高免疫力
动物多糖具有抗肿瘤、提高免疫力作用。研究表明，玉足海参多糖[1]对实验小鼠乳腺癌、肺癌、黑色素瘤均具有显著的生长抑制率。多糖抗癌的原因大多是激活了体内免疫系统，改善了机体免疫力。从皱纹盘鲍中提取的鲍鱼多糖能够明显增加巨噬细胞吞噬能力，增强迟发超敏反应。这种免疫增强作用可能是其抗肿瘤作用的机理。此外还发现三角帆蚌多糖[2]、文蛤多糖、鹿茸多糖、蚕蛹多糖、泥鳅多糖、乌贼墨、鳖鱼软骨素、海参等具有抗肿瘤和增强免疫力的活性。多糖应用于肿瘤治疗将是一个新的迷人的领域。
1.1.2 抗凝血、抗血栓
从动物材料中提取的肝素、低分子肝素等小分子多糖和其他一些酸性粘多糖能够抑制凝血蛋白酶原转变成凝血酶，具有抗凝血作用。刺参酸性粘多糖[3]能够抑制纤维蛋白单体的聚集，机理是提高纤溶活性，增加纤溶敏感性，改变凝胶结构以促进纤溶和直接降解纤维蛋白。从中国林蛙头分离的林蛙多糖[4]具有抗凝血活性，但它的抗凝活性要比肝素小得多。考虑到肝素在临床上有出血的倾向和动物多糖类物质的多种生物活性，抗凝作用小得林蛙多糖有更广阔的药用和食用价值。玉足海参[5]中提取的酸性粘多糖已研制成玉足海参胶囊，具有抗凝和降低血粘的功效。
1.1.3 降血糖、降血脂
泥鳅多糖MAP具有降血糖和调节血脂的作用[6],实验证明，MAP能明显降低链佐星或四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖升高；同时，MAP还能明显降低链佐星或四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血清中的总胆固醇、甘油三酷和低密度脂蛋白胆固醇升高。此外鳖鱼软骨酸性多糖也具有一定的降血脂的作用，机理可能与其提高毛细血管内脂蛋白脂酶活性并促进该酶释放有关。
1.1.4 抗氧化、抗衰老
泥鳅多糖[7]具有清除活性氧的作用和对OH导致DNA链损伤的抑制作用。实验表明泥鳅多糖能够有效地清除O2、0H、H20等活性氧，对DNA链具有良好的保护作用。从猪十二指肠粘膜中提取的中性复合粘多糖具有减轻脑缺血再灌注损伤的作用，体外实验证明它有抗氧化作用[8]。
1.1.5 抗炎、抗疲劳
泥鳅多糖的抗炎效果与地塞米松无显著差异，甚至有的作用还略强于地塞米松磷酸钠注射液，并且呈一定的量效关系。近年来已证实具有抗疲劳作用的动物多糖有：中华鳖多糖、壳聚糖[9]。研究表明，壳聚糖具有极显著的抗疲劳活性，壳聚糖能显著延长小白鼠负重游泳时间，能有效减轻运动机体中乳酸的堆积并能迅速消除堆积的乳酸，增强有氧代谢耐力，提高小白鼠机体运动能力，从而延缓小鼠机体疲劳的发生并加速疲劳的恢复。
1.2 多糖的提取方法
1.2.1 水提取法
水煎煮法是多糖提取的传统方法，是用水作为溶剂煎煮提取多糖。因为多糖在冷水中溶解度较低，一般要在70-90℃热水中回流提取2～3ｈ，将提取液真空浓缩后加入乙醇将多糖析出。目前多数国内文献采用水煎煮法提取多糖，如盛家荣等采用此法从板蓝根中提取多糖，李志洲等[10]采用该法提取大枣多糖。该法具有设备简单、操作方便、适用面广等优点。但是这种方法也存在操作时间长，收率低，并需多次反复操作，能耗较高等缺点。黄琳娟等[11]人研究枸杞多糖时，采用水提法先浸泡24h，过滤后残渣再用水浸泡6h，操作周期过长。
1.2.2 碱提法
含有糠醛酸的多糖及酸性多糖适合用碱提法提取，其原理是动物细胞在碱液中会吸水溶胀以至于破裂，使细胞中多糖释放并溶解在稀碱溶液中，使其提取率大大提高。常用的碱液有氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠。但有些多糖在碱性较强的环境下会水解，为了防止多糖降解，通常通入氮气或加入硼氢化钠（钾）来保护多糖。碱提法提取多糖的主要影响因素是碱的浓度、提取温度、及提取时间。
碱提取法只在一些特定的多糖提取中占有优势，而且在碱提中，碱的浓度应该得到有效的控制，另外，稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩，然后醇沉，获得多糖沉淀。
在对粗多糖进行完脱蛋白的过程之后，要想得到纯度更高的多糖，更重要的是多糖的分离纯化工艺。纯化的目的是将粗多糖的杂质去除而得到单一的多糖组分，目前已经被报道出来的纯化方法有以下几种：
1.5.1 分级沉淀法
分级沉淀法是指在混合组分的溶液中加入与该溶液能互溶的溶剂，通过改变溶剂的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。分级沉淀是用不同浓度的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等来分级沉淀纯化多糖，一般采用乙醇作为溶剂的较多。如在粗多糖的水溶液中，分次加入乙醇使含醇量逐步增加，使得粗多糖通过不同的乙醇体积分数得到不同的组分。采用乙醇分级沉淀法提取的香菇多糖中，结果表明，当乙醇体积为30%-50%时，得到的多糖含量最高。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。
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