人参内源酶及其酶学性质研究(附件)
目的 人参为一种名贵中药材，人参加工过程中其自身内源酶作用仍未相关研究，本文旨在建立人参内源酶制备方法及进行酶学性质研究。方法 采用缓冲液冷浸法提取人参内源酶，用pNP显色法测定内源酶活性及考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量，比较不同分子量酚类除去剂对提取的影响，及进行酶学性质研究。结果 pNP显色法及考马斯亮蓝法可有效测定其内源酶活性及蛋白含量；酚类除去剂可有效改善内源酶提取率，其中PVPP为最适酚类除去剂；人参内源糖苷酶的最适反应温度为50℃、最适pH为5.0、最适底物浓度为2 mmoL/L pNPGP，在最适反应条件下，其人参内源酶活力为595.84 U/mL，Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Ag+等金属离子对人参内源酶活性有强抑制作用，Mg2+有轻微抑制作用，Fe2+和Cu2+有轻微促活作用。结论 人参可作为糖苷酶提取的一种重要原料，酚类去除剂可显著影响内源酶提取率，人参内源糖苷酶在加工过程的作用机制仍有待进一步深入研究。关键词 人参，内源酶，糖苷酶，对硝基苯酚显色法，考马斯亮蓝法
目 录
1 引言 1
1.1 人参内源酶提取方法 2
1.2 人参内源酶的酶学性质研究 3
1.3 研究意义及内容 4
2 实验部分 5
2.1 实验仪器与实验材料 5
2.2 人参内源酶的提取 7
2.3 pNP标准曲线的绘制 7
2.4 牛血清蛋白标准曲线的绘制 8
2.5 蛋白含量的测定 9
2.6 总酶活力的测定 9
2.7 酶学性质研究 10
3 结果与分析 11
3.1 pNP标准曲线 11
3.2 蛋白质标准曲线 13
3.3 人参内源酶提取实验结果与分析 15
3.4 酶学活性研究实验结果与分析 17
结 论 21
致 谢 22
参 考 文 献 23
1 引言
人参，又取名为圆参（Panax ginseng C. A. Mey），系五加科植物人参的干燥根[1]，喜阴凉，叶片没有气孔组织，所以水分不能保留。若温度在32℃以上，叶片将会被灼伤，树冠 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的郁闭度在0.70.8之间。通常3年开一次花，56年首次结果实，其花期在5 6月份之间，果期为69月份之间。生长于北纬33度 48度之间的针阔混交林或阔叶林下。人参原产于亚洲，主要生长在中国、韩国和日本等地[2]。同时人参作为我国传统名贵中草药材在国内外具有广泛应用[3]，因此它也被赋予了“百草之王”的称号，是闻名的“东北三宝”之一。《本草纲目》 、《神农本草经》等名著中均有过对人参药用方面的介绍。目前为止世界上经发现和鉴别的参的种类共有13种，其中最常用的且最多的参是人参和西洋参（Panax quinquefolius L），如图1所示。
图1 人参
中医研究认为，人参性平、微温，可以补脾肺之气，并且有安神的作用，经常使用于治疗身体虚弱、心神不宁、健忘等这类人群[4]。 人参的主要成分含有皂苷类、糖类、蛋白质、黄酮类、维生素类、酶类以及微量元素等成分[5,6]，其中含量最多的成分是人参皂苷类[7] 。现代医学研究的结果表明，人参皂苷类能够保护人的心脏、抗肿瘤、促进细胞造血功能、增强人体免疫力等[8,9]。其中人参中含有的二醇类（PPD）皂苷 Rb1 等在人参皂苷中的含量较多，大概在总皂苷的45% 60%之间。而具备抗癌功效的人参二醇类（PPD）皂苷Rh2[10]在人参中的含量十分稀少，仅有其0.0001%左右。由此为了获取更高药用价值的皂苷Rh2，就需要将人参皂苷的糖基结构进行相关的改造。
1.1 人参内源酶提取方法
1.1.1 复合酶法提取
绝大部分植物含有的有效成分储存在其细胞壁上，而且多数细胞的组织主要由结构蛋白、纤维素类、半纤维素类等成分组成。鉴于采取复合酶法提取的方式具备工艺条件温和、反应的时间短、酶的专属性强等诸类特点，目前，此方法已经被广泛使用于人参的有效成分的提取工艺中。同时，利用酶处理，可以有效的改变植物细胞壁的通透性，更有利于提取植物的有效成分[11]。所以将复合酶法引入人参的提取工艺，可以提高人参皂苷β葡萄糖苷酶的收率。赵岩等[12]通过选取复合酶法的方式，以人参皂苷β葡萄糖苷酶得率作为指标，通过采取正交试验及单因素实验的方式来确定这些复合酶作用的最佳工艺条件。结果发现拟用复合酶法提取人参内源酶的最佳工艺条件为：中性的蛋白酶含量1%，提取的时间为2 h，温度在60 ℃ 左右。按此条件进行试验，所得提取率为5.44%；王野[13]选取包含纤维素酶、漆酶和半纤维素酶这三种酶组成的复合酶用于提取人参皂苷内源酶，结果发现人参内源酶提取工艺的最优条件为：酶解温度在55℃左右、pH在5.0左右、向每10 g人参粉末中补加纤维素酶0.5 g、漆酶1.5 g和半纤维素酶0.10 g，酶解的时间为2 h。按此条件进行实验，测得人参皂苷内源酶的得率为5.37%。
1.1.2 水提乙醇沉淀法
刘洋[14]通过研究乙醇浓度、提取温度、提取时间以及提取次数对人参皂苷β葡萄糖苷酶收率的影响，利用了正交试验和单因素实验，设计和优化了水提醇沉法提取人参皂苷β葡萄糖苷酶的工艺条件，结果表明。人参内源酶提取工艺的最优条件为：人参根经粉碎并且过60目的筛网，料液的比例（g/mL）为1：40，醇提的时间为50 min。测得人参皂苷β葡萄糖苷酶的提取率为 5.91%。
1.1.3 超声波提取法
在绝大多数药物的有效组成部分的提取过程当中，采取超声波提取法的关键是使用超声波所产生的空化、震动、搅拌等作用，使得提取过程更为快捷和高效，巢艳红等[15]在专研人参皂苷β葡萄糖苷酶的提取工艺过程当中，结果得出人参内源酶的提取工艺的最优条件为：以75% 的乙醇作为超声提取的溶剂，料液的比例为1：15，提取的温度为 60℃左右。人参皂苷β葡萄糖苷酶的得率为 3.567%。
1.1.4 超临界CO2萃取法
超临界CO2萃取法的原理是将温度和压力设定在高于 CO2的临界值之上，使其变成密度和液体相似、具有单一相态的超临界流体。同时具备粘稠度低和扩散性强的特点，所以较一般液体的溶解能力强。樊红秀等[16]经过单因素试验的方式探讨研究了超临界CO2萃取法中萃取方式、萃取温度、萃取的时间和萃取的次数对人参皂苷β葡萄糖苷酶收率的影响，探究的结果显示：准确称取100 g人参根经粉碎且过60目的筛网，使用70%的乙醇溶液作为夹带剂，萃取的压力稳定在30 Mpa，萃取的温度在45℃左右，萃取的时间维持在4 h，准确量取夹带剂用量为200 mL以及萃取的次数为2次的前提下进行超临界CO2萃取法提取人参内源酶，最终人参皂苷β葡萄糖苷酶的收率可达到1.1053%。刘鸿铖[17]通过以超临界脱脂后的萃取残余物质作为提取的原料，采取超声超临界CO2萃取法来提取人参内源酶最优工艺前提为：萃取压力维持在35 MPa，萃取的温度在45℃左右，萃取的时间精确在2.5 h，原料和夹带剂（g/mL）的比例为1：3，并且夹带剂的浓度为70%，最终在此条件下人参皂苷β葡萄糖苷酶的得率为2.251%。
目 录
1 引言 1
1.1 人参内源酶提取方法 2
1.2 人参内源酶的酶学性质研究 3
1.3 研究意义及内容 4
2 实验部分 5
2.1 实验仪器与实验材料 5
2.2 人参内源酶的提取 7
2.3 pNP标准曲线的绘制 7
2.4 牛血清蛋白标准曲线的绘制 8
2.5 蛋白含量的测定 9
2.6 总酶活力的测定 9
2.7 酶学性质研究 10
3 结果与分析 11
3.1 pNP标准曲线 11
3.2 蛋白质标准曲线 13
3.3 人参内源酶提取实验结果与分析 15
3.4 酶学活性研究实验结果与分析 17
结 论 21
致 谢 22
参 考 文 献 23
1 引言
人参，又取名为圆参（Panax ginseng C. A. Mey），系五加科植物人参的干燥根[1]，喜阴凉，叶片没有气孔组织，所以水分不能保留。若温度在32℃以上，叶片将会被灼伤，树冠 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的郁闭度在0.70.8之间。通常3年开一次花，56年首次结果实，其花期在5 6月份之间，果期为69月份之间。生长于北纬33度 48度之间的针阔混交林或阔叶林下。人参原产于亚洲，主要生长在中国、韩国和日本等地[2]。同时人参作为我国传统名贵中草药材在国内外具有广泛应用[3]，因此它也被赋予了“百草之王”的称号，是闻名的“东北三宝”之一。《本草纲目》 、《神农本草经》等名著中均有过对人参药用方面的介绍。目前为止世界上经发现和鉴别的参的种类共有13种，其中最常用的且最多的参是人参和西洋参（Panax quinquefolius L），如图1所示。
图1 人参
中医研究认为，人参性平、微温，可以补脾肺之气，并且有安神的作用，经常使用于治疗身体虚弱、心神不宁、健忘等这类人群[4]。 人参的主要成分含有皂苷类、糖类、蛋白质、黄酮类、维生素类、酶类以及微量元素等成分[5,6]，其中含量最多的成分是人参皂苷类[7] 。现代医学研究的结果表明，人参皂苷类能够保护人的心脏、抗肿瘤、促进细胞造血功能、增强人体免疫力等[8,9]。其中人参中含有的二醇类（PPD）皂苷 Rb1 等在人参皂苷中的含量较多，大概在总皂苷的45% 60%之间。而具备抗癌功效的人参二醇类（PPD）皂苷Rh2[10]在人参中的含量十分稀少，仅有其0.0001%左右。由此为了获取更高药用价值的皂苷Rh2，就需要将人参皂苷的糖基结构进行相关的改造。
1.1 人参内源酶提取方法
1.1.1 复合酶法提取
绝大部分植物含有的有效成分储存在其细胞壁上，而且多数细胞的组织主要由结构蛋白、纤维素类、半纤维素类等成分组成。鉴于采取复合酶法提取的方式具备工艺条件温和、反应的时间短、酶的专属性强等诸类特点，目前，此方法已经被广泛使用于人参的有效成分的提取工艺中。同时，利用酶处理，可以有效的改变植物细胞壁的通透性，更有利于提取植物的有效成分[11]。所以将复合酶法引入人参的提取工艺，可以提高人参皂苷β葡萄糖苷酶的收率。赵岩等[12]通过选取复合酶法的方式，以人参皂苷β葡萄糖苷酶得率作为指标，通过采取正交试验及单因素实验的方式来确定这些复合酶作用的最佳工艺条件。结果发现拟用复合酶法提取人参内源酶的最佳工艺条件为：中性的蛋白酶含量1%，提取的时间为2 h，温度在60 ℃ 左右。按此条件进行试验，所得提取率为5.44%；王野[13]选取包含纤维素酶、漆酶和半纤维素酶这三种酶组成的复合酶用于提取人参皂苷内源酶，结果发现人参内源酶提取工艺的最优条件为：酶解温度在55℃左右、pH在5.0左右、向每10 g人参粉末中补加纤维素酶0.5 g、漆酶1.5 g和半纤维素酶0.10 g，酶解的时间为2 h。按此条件进行实验，测得人参皂苷内源酶的得率为5.37%。
1.1.2 水提乙醇沉淀法
刘洋[14]通过研究乙醇浓度、提取温度、提取时间以及提取次数对人参皂苷β葡萄糖苷酶收率的影响，利用了正交试验和单因素实验，设计和优化了水提醇沉法提取人参皂苷β葡萄糖苷酶的工艺条件，结果表明。人参内源酶提取工艺的最优条件为：人参根经粉碎并且过60目的筛网，料液的比例（g/mL）为1：40，醇提的时间为50 min。测得人参皂苷β葡萄糖苷酶的提取率为 5.91%。
1.1.3 超声波提取法
在绝大多数药物的有效组成部分的提取过程当中，采取超声波提取法的关键是使用超声波所产生的空化、震动、搅拌等作用，使得提取过程更为快捷和高效，巢艳红等[15]在专研人参皂苷β葡萄糖苷酶的提取工艺过程当中，结果得出人参内源酶的提取工艺的最优条件为：以75% 的乙醇作为超声提取的溶剂，料液的比例为1：15，提取的温度为 60℃左右。人参皂苷β葡萄糖苷酶的得率为 3.567%。
1.1.4 超临界CO2萃取法
超临界CO2萃取法的原理是将温度和压力设定在高于 CO2的临界值之上，使其变成密度和液体相似、具有单一相态的超临界流体。同时具备粘稠度低和扩散性强的特点，所以较一般液体的溶解能力强。樊红秀等[16]经过单因素试验的方式探讨研究了超临界CO2萃取法中萃取方式、萃取温度、萃取的时间和萃取的次数对人参皂苷β葡萄糖苷酶收率的影响，探究的结果显示：准确称取100 g人参根经粉碎且过60目的筛网，使用70%的乙醇溶液作为夹带剂，萃取的压力稳定在30 Mpa，萃取的温度在45℃左右，萃取的时间维持在4 h，准确量取夹带剂用量为200 mL以及萃取的次数为2次的前提下进行超临界CO2萃取法提取人参内源酶，最终人参皂苷β葡萄糖苷酶的收率可达到1.1053%。刘鸿铖[17]通过以超临界脱脂后的萃取残余物质作为提取的原料，采取超声超临界CO2萃取法来提取人参内源酶最优工艺前提为：萃取压力维持在35 MPa，萃取的温度在45℃左右，萃取的时间精确在2.5 h，原料和夹带剂（g/mL）的比例为1：3，并且夹带剂的浓度为70%，最终在此条件下人参皂苷β葡萄糖苷酶的得率为2.251%。
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