驱动蛋白eg5的表达和纯化(附件)
: 驱动蛋白Eg5，又名驱动蛋白超家族成员11，是一类具有水解ATP功能的蛋白质，通过水解释放的能量沿微管系统运动驱动分子马达，为细胞器与囊泡的运输提供能量。Eg5是生物代谢活动的重要调节物质，在体内参与有丝分裂和减数分裂的过程，对纺锤体的形成有抑制作用，这一功能给药物研发领域提供了理论支持，引起了许多医学研究者的重视。为了研究Eg5的一些性质，如酶活力大小和结晶研究等，并对Eg5的表达纯化技术进行改进，本文采用构建融合质粒的方法，使Eg5在Rosetta感受态中高效表达。实验中还将组氨酸标签与蛋白质结合，通过Ni亲和层析柱对Eg5进行分离纯化，然后使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离纯化的结果进行分析，得到了高纯度的蛋白。文章最后还对蛋白质浓缩处理，并初步进行结晶实验，观察到了Eg5在不同条件下的结晶形态，为驱动蛋白Eg5的研究提供了一些帮助。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2实验方法 4
1.2.1培养基和培养条件4
1.2.2细胞的转化4
1.2.3 Eg5基因在原核细胞内的表达4
1.2.4蛋白质的纯化4
1.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5
1.2.6结晶6
2结果与分析6
2.1结果6
2.1.1表达纯化6
2.1.2凝胶电泳6
2.1.3结晶7
2.2 分析9
2.2.1 表达纯化9
2.2.2 结晶9
3讨论10
致谢10
参考文献10
驱动蛋白Eg5的表达和纯化
应用化学131 张欣凯
引言
分子马达是生物体细胞内一类具有马达功能的蛋白质大分子，它能够为细胞内物质的运输提供动力。驱动蛋白是一类ATP水解酶，广泛存在于真核生物中，在增殖细胞中高表达，利用水解ATP释放的能量，将化学能转化为机械能，能量沿微管系统运动来驱动分子马达[1]。驱动蛋白主要参与细胞器和囊 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
泡的运输，以及染色体的转移，在细胞有丝分裂和减数分裂的过程中起到关键作用，并且对大脑发育，神经元活性和记忆功能等都有着关键的影响，可以说，驱动蛋白在生物体的生长发育中起到了至关重要的作用[2]。
美国加州大学实验室的Vale等人在1985年首次在鱿鱼和哺乳动物神经组织中发现了驱动蛋白，并且截止到目前，研究人员先后在人类和小鼠体内发现共45种驱动蛋白[3]。驱动蛋白从结构上由几个单体缠绕组合形成多聚体，可以分成头部、颈部、躯干、尾部四个区域。“头部”具有ATP酶活性，能够水解ATP获得能量，同时头部构型发生变化，从而使驱动蛋白沿着微管运动[4]。“尾部”能够识别膜状细胞器及囊泡物质，与需要转移的细胞器或染色体结合，负责货物的绑定。“颈部”和“躯干”负责分开头部和尾部。“颈部”是驱动蛋白力产生的重要元件，由1418个氨基酸组成，连接着分子马达的结构域和由缠绕螺旋构成的茎部，通过多种与水分子相关的弱键相互作用如氢键、盐键和疏水相互作用等[5]，实现与分子马达结构域的对接。
目前用于临床抗肿瘤治疗的紫杉醇和长春碱主要通过作用于微管而达到抑制纺锤体形成[6]，阻止有丝分裂期细胞的活动，最终杀死细胞，但长期使用除了产生抗药性，更可造成不可逆的神经毒损伤。相比之下，Eg5在有丝分裂中对纺锤体的形成有着抑制作用，导致细胞周期停滞，但并不影响微管系统的稳定性，从而有效的避免了神经毒性的影响[7]。Eg5在细胞内定位于纺锤体的中央区，但其定位需要哪些分子辅助的精确机制目前还不清楚[8]。利用Eg5的这个特点，已有研究人员开发出用于治疗肿瘤的靶向治疗药物和抑制癌细胞的药物[9]，Eg5在医学上取得的成就引起了更多专家和学者的重视。通过改变基因构象来对Eg5的性质进行改造，使它具备更为应用需要的属性，如热稳定性和更高的特异性等[10]，是现在努力研究和发展的方向。
本文通过质粒的转化培养，使Eg5在大肠杆菌中高效表达，并用Ni柱亲和层析对蛋白质进行纯化，最后对得到的蛋白质进行了晶体分析，确认了驱动蛋白Eg5的一些性质。
1.材料与方法
1.1 材料
实验所用试剂
名称
纯度
生产厂家
Eg5质粒
一
金唯智
Rosetta（DE3）
一
江苏众红生物工程创药研究院有限公司
TEV蛋白酶
一
实验室自行纯化
LB
一
MDBio
Agar
生物试剂纯
南京化学试剂有限公司
IPTG
≥99%
Biosharp
Pipes
≥99%
VETEC
丙三醇（甘油）
分析纯
南京化学试剂有限公司
PMSF
≥98.5%
西格玛奥德里奇
DTT
≥99%
阿拉丁
Trizma base
≥99%
VETEC
Imidazole
≥99%
阿拉丁
MgCl26H2O
分析纯
西陇化工股份有限公司
EGTA
≥99%
阿拉丁
KCl
分析纯
国药集团化学试剂有限公司
NaCl
分析纯
南京化学试剂有限公司
SDS
≥97%
阿拉丁
Kanamycin
>94.0%
阿拉丁
Acrylamide/Bis Soin
30%
MDBio
APS（过硫酸铵）
分析纯
南京化学试剂有限公司
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2实验方法 4
1.2.1培养基和培养条件4
1.2.2细胞的转化4
1.2.3 Eg5基因在原核细胞内的表达4
1.2.4蛋白质的纯化4
1.2.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5
1.2.6结晶6
2结果与分析6
2.1结果6
2.1.1表达纯化6
2.1.2凝胶电泳6
2.1.3结晶7
2.2 分析9
2.2.1 表达纯化9
2.2.2 结晶9
3讨论10
致谢10
参考文献10
驱动蛋白Eg5的表达和纯化
应用化学131 张欣凯
引言
分子马达是生物体细胞内一类具有马达功能的蛋白质大分子，它能够为细胞内物质的运输提供动力。驱动蛋白是一类ATP水解酶，广泛存在于真核生物中，在增殖细胞中高表达，利用水解ATP释放的能量，将化学能转化为机械能，能量沿微管系统运动来驱动分子马达[1]。驱动蛋白主要参与细胞器和囊 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
泡的运输，以及染色体的转移，在细胞有丝分裂和减数分裂的过程中起到关键作用，并且对大脑发育，神经元活性和记忆功能等都有着关键的影响，可以说，驱动蛋白在生物体的生长发育中起到了至关重要的作用[2]。
美国加州大学实验室的Vale等人在1985年首次在鱿鱼和哺乳动物神经组织中发现了驱动蛋白，并且截止到目前，研究人员先后在人类和小鼠体内发现共45种驱动蛋白[3]。驱动蛋白从结构上由几个单体缠绕组合形成多聚体，可以分成头部、颈部、躯干、尾部四个区域。“头部”具有ATP酶活性，能够水解ATP获得能量，同时头部构型发生变化，从而使驱动蛋白沿着微管运动[4]。“尾部”能够识别膜状细胞器及囊泡物质，与需要转移的细胞器或染色体结合，负责货物的绑定。“颈部”和“躯干”负责分开头部和尾部。“颈部”是驱动蛋白力产生的重要元件，由1418个氨基酸组成，连接着分子马达的结构域和由缠绕螺旋构成的茎部，通过多种与水分子相关的弱键相互作用如氢键、盐键和疏水相互作用等[5]，实现与分子马达结构域的对接。
目前用于临床抗肿瘤治疗的紫杉醇和长春碱主要通过作用于微管而达到抑制纺锤体形成[6]，阻止有丝分裂期细胞的活动，最终杀死细胞，但长期使用除了产生抗药性，更可造成不可逆的神经毒损伤。相比之下，Eg5在有丝分裂中对纺锤体的形成有着抑制作用，导致细胞周期停滞，但并不影响微管系统的稳定性，从而有效的避免了神经毒性的影响[7]。Eg5在细胞内定位于纺锤体的中央区，但其定位需要哪些分子辅助的精确机制目前还不清楚[8]。利用Eg5的这个特点，已有研究人员开发出用于治疗肿瘤的靶向治疗药物和抑制癌细胞的药物[9]，Eg5在医学上取得的成就引起了更多专家和学者的重视。通过改变基因构象来对Eg5的性质进行改造，使它具备更为应用需要的属性，如热稳定性和更高的特异性等[10]，是现在努力研究和发展的方向。
本文通过质粒的转化培养，使Eg5在大肠杆菌中高效表达，并用Ni柱亲和层析对蛋白质进行纯化，最后对得到的蛋白质进行了晶体分析，确认了驱动蛋白Eg5的一些性质。
1.材料与方法
1.1 材料
实验所用试剂
名称
纯度
生产厂家
Eg5质粒
一
金唯智
Rosetta（DE3）
一
江苏众红生物工程创药研究院有限公司
TEV蛋白酶
一
实验室自行纯化
LB
一
MDBio
Agar
生物试剂纯
南京化学试剂有限公司
IPTG
≥99%
Biosharp
Pipes
≥99%
VETEC
丙三醇（甘油）
分析纯
南京化学试剂有限公司
PMSF
≥98.5%
西格玛奥德里奇
DTT
≥99%
阿拉丁
Trizma base
≥99%
VETEC
Imidazole
≥99%
阿拉丁
MgCl26H2O
分析纯
西陇化工股份有限公司
EGTA
≥99%
阿拉丁
KCl
分析纯
国药集团化学试剂有限公司
NaCl
分析纯
南京化学试剂有限公司
SDS
≥97%
阿拉丁
Kanamycin
>94.0%
阿拉丁
Acrylamide/Bis Soin
30%
MDBio
APS（过硫酸铵）
分析纯
南京化学试剂有限公司
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