生物被膜的提取及官能组分分析
生物被膜（biofilms，BF）是菌体及其分泌的多聚物积聚而形成的菌落膜样物，是菌体为适应自然环境而形成的一种独特的生命现象。理解被膜的环境行为，必须对微生物分泌的胞外聚合物质的物化属性进行深入探讨。从1978年Costerton开创生物被膜这个概念以来，相关课题就一直处于热门状态。近年来各类污染日益严重，人们防范与治理的意识也逐渐加强，认识到控制环境污染的重要性。虽然生物被膜会保护致病菌，使其具有抗药性，但其也有积极的作用。有研究表明，胞外聚合物（Extracellular Polymeric substance，EPS）具有去除水中重金属的能力，从而减轻水体污染，而它的能力与其组分、结构和特性有关。研究生物被膜也成了控制污染的关键所在，本文从化学的角度出发，通过科学的方法提取出菌体上的多聚物，测定其中的有机碳含量，并通过红外光谱与滴定得到的性质探讨可能存在的基团。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2仪器 2
1.3方法 2
1.3.1准备（培养）2
1.3.2提取2
1.3.3冻干及称重2
1.3.4 TOC测定及红外光谱2
1.3.5电位滴定2
2结果与分析2
2.1提取方法分析2
2.2总有机碳含量分析3
2.3官能团分析4
3讨论6
3.1结论6
3.2研究展望6
致谢6
参考文献6 生物被膜的提取及官能组分分析
引言
引言
1 材料与方法
1．1 材料
大肠杆菌、枯草杆菌、LB培养基、透析袋、封口膜、超纯水、HCl溶液和NaOH溶液等。
1．2 仪器
恒温培养箱、超声清洗机、pH计、电位计、冷冻干燥机、离心机、总有机碳分析仪、磁力搅拌器、灭菌锅。
1．3 方法
1．3．1 准备（培养） 配置LB培养基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
，封口并放入灭菌锅中高温蒸煮20分钟。冷却后在无菌环境中将所需菌体种入培养基中（接种量为1%），再次封口，置于恒温箱中37℃状态下摇荡培养48h。
1．3．2 提取 取出培养好的菌液，在无菌环境下用移液枪移取1%的菌液放入4℃冰箱中保存以留备用。取出6支50mL离心管，菌液倒入其中，将装有菌液的离心管以3000g初步离心6分钟，移除上清液。不断重复离心步骤来浓缩生物被膜，全部离心后，在离心管中加入超纯水至原体积，悬浮3分钟，再次离心去除上清液以去除残留的LB培养基。之后再加超纯水至原体积，悬浮菌体后移至超声清洗机中，以60W下工作7分钟，使EPS与菌体分离。取出擦干，放入离心机，以11200g、4℃下离心20分钟。离心后保留上清液，经0.45μm滤膜抽滤，移除残留的菌体。最后将上清液装入3500Da的透析袋中，透析24h去除菌体破裂后溶解在水中的小分子，收集透析袋内液体，为EPS溶液。
1．3．3 冻干及称重 将EPS溶液放入冰箱中冷冻6h，冻好后放入冷冻干燥机中，直到只剩下EPS固体，拿出后再放入105℃烘箱中烘干3~4h，然后自然冷却称重（三个平行）。
1．3．4 TOC测定及红外光谱 重复以上步骤直至提取到足够量的EPS，然后拿到总有机碳分析仪高温燃烧检测CO2，系统会根据检测到的CO2自动作图，以葡萄糖为标样，通过线性回归方程来得到峰面积与绝对碳量的定量关系，然后再根据图中峰面积求出TC和IC，再用加减法求出TOC。之后还要用得到的EPS做红外光谱分析，先称取烘干的KBr粉末0.5g，放置研磨器中仔细研磨过后过筛，之后放入压片磨具中压片，装入样品池扫描得出背景谱图。将样品烘干，取5mg样品与0.5gKBr粉末放入研磨器中研磨混匀，之后过筛压片，放入样品池，扫描得样品谱图。
1．3．5 电位滴定 透析后的EPS溶液直接使用，用一根ORP复合电极测电位，一根pH复合电极测pH。首先将溶液调成酸性2.0附近，逐渐往里面滴加NaOH溶液，每一次稳定后，记录电位以及Ph值，直到滴加到pH12。
2 结果与分析
2．1 提取方法分析
大肠杆菌EPS干重（mg）
大肠杆菌EPS
1
2
3
平均值
第一次提取
2.9
2.9
3.2
3.0
第二次提取
3.0
3.2
2.8
3.0
第三次提取
4.2
4.1
3.9
4.2
第四次提取
15.2
15.1
15.6
15.3
表1
枯草杆菌EPS干重（mg）
枯草杆菌EPS
1
2
3
平均值
第一次提取
4.8
4.8
4.8
4.8
第二次提取
11.2
11.6
11.7
11.5
第三次提取
5.2
5.4
5.3
5.3
第四次提取
20.8
20.6
21.0
20.8
表2
通过每次提取出来的干重数据对比，以及冻干后EPS的状态可发现每次提取出来的EPS都有一定差距，枯草菌提取出来的EPS颜色不一致，推测可能为密度不同或透析不彻底所导致。提取方法的使用是本实验之后测定的基础，选用一条合理的提取路线是整个实验进行下去的关键。不同的提取方法提取出EPS的属性也不尽相同，理想的方法应对EPS没有影响或影响可以忽略不计，并且提取效率也非常高。然而由于EPS的复杂性以及EPS与菌体的相容性，理想的提取方法并未找到。根据前辈们的研究可知主要的提取方法分为化学方法与物理方法，物理方法主要有直接离心法、超声波法、离子交换树脂法、蒸汽法和热提法，而化学方法有硫酸提取法、NaOH提取法、甲醛提取法等。化学方法因为用药品参与分离，所以提取效率非常高，但是容易对基团产生破坏，并且在之后的过程不会发生逆反应变回初始状态，因此药品的加入大幅度改变EPS的性质。对于我们之后的测定不利，而物理方法提取效率虽然低，但是基本不会改变EPS的生物活性，是之后的测定也更准确，因此我们采用物理方法。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2仪器 2
1.3方法 2
1.3.1准备（培养）2
1.3.2提取2
1.3.3冻干及称重2
1.3.4 TOC测定及红外光谱2
1.3.5电位滴定2
2结果与分析2
2.1提取方法分析2
2.2总有机碳含量分析3
2.3官能团分析4
3讨论6
3.1结论6
3.2研究展望6
致谢6
参考文献6 生物被膜的提取及官能组分分析
引言
引言
1 材料与方法
1．1 材料
大肠杆菌、枯草杆菌、LB培养基、透析袋、封口膜、超纯水、HCl溶液和NaOH溶液等。
1．2 仪器
恒温培养箱、超声清洗机、pH计、电位计、冷冻干燥机、离心机、总有机碳分析仪、磁力搅拌器、灭菌锅。
1．3 方法
1．3．1 准备（培养） 配置LB培养基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
，封口并放入灭菌锅中高温蒸煮20分钟。冷却后在无菌环境中将所需菌体种入培养基中（接种量为1%），再次封口，置于恒温箱中37℃状态下摇荡培养48h。
1．3．2 提取 取出培养好的菌液，在无菌环境下用移液枪移取1%的菌液放入4℃冰箱中保存以留备用。取出6支50mL离心管，菌液倒入其中，将装有菌液的离心管以3000g初步离心6分钟，移除上清液。不断重复离心步骤来浓缩生物被膜，全部离心后，在离心管中加入超纯水至原体积，悬浮3分钟，再次离心去除上清液以去除残留的LB培养基。之后再加超纯水至原体积，悬浮菌体后移至超声清洗机中，以60W下工作7分钟，使EPS与菌体分离。取出擦干，放入离心机，以11200g、4℃下离心20分钟。离心后保留上清液，经0.45μm滤膜抽滤，移除残留的菌体。最后将上清液装入3500Da的透析袋中，透析24h去除菌体破裂后溶解在水中的小分子，收集透析袋内液体，为EPS溶液。
1．3．3 冻干及称重 将EPS溶液放入冰箱中冷冻6h，冻好后放入冷冻干燥机中，直到只剩下EPS固体，拿出后再放入105℃烘箱中烘干3~4h，然后自然冷却称重（三个平行）。
1．3．4 TOC测定及红外光谱 重复以上步骤直至提取到足够量的EPS，然后拿到总有机碳分析仪高温燃烧检测CO2，系统会根据检测到的CO2自动作图，以葡萄糖为标样，通过线性回归方程来得到峰面积与绝对碳量的定量关系，然后再根据图中峰面积求出TC和IC，再用加减法求出TOC。之后还要用得到的EPS做红外光谱分析，先称取烘干的KBr粉末0.5g，放置研磨器中仔细研磨过后过筛，之后放入压片磨具中压片，装入样品池扫描得出背景谱图。将样品烘干，取5mg样品与0.5gKBr粉末放入研磨器中研磨混匀，之后过筛压片，放入样品池，扫描得样品谱图。
1．3．5 电位滴定 透析后的EPS溶液直接使用，用一根ORP复合电极测电位，一根pH复合电极测pH。首先将溶液调成酸性2.0附近，逐渐往里面滴加NaOH溶液，每一次稳定后，记录电位以及Ph值，直到滴加到pH12。
2 结果与分析
2．1 提取方法分析
大肠杆菌EPS干重（mg）
大肠杆菌EPS
1
2
3
平均值
第一次提取
2.9
2.9
3.2
3.0
第二次提取
3.0
3.2
2.8
3.0
第三次提取
4.2
4.1
3.9
4.2
第四次提取
15.2
15.1
15.6
15.3
表1
枯草杆菌EPS干重（mg）
枯草杆菌EPS
1
2
3
平均值
第一次提取
4.8
4.8
4.8
4.8
第二次提取
11.2
11.6
11.7
11.5
第三次提取
5.2
5.4
5.3
5.3
第四次提取
20.8
20.6
21.0
20.8
表2
通过每次提取出来的干重数据对比，以及冻干后EPS的状态可发现每次提取出来的EPS都有一定差距，枯草菌提取出来的EPS颜色不一致，推测可能为密度不同或透析不彻底所导致。提取方法的使用是本实验之后测定的基础，选用一条合理的提取路线是整个实验进行下去的关键。不同的提取方法提取出EPS的属性也不尽相同，理想的方法应对EPS没有影响或影响可以忽略不计，并且提取效率也非常高。然而由于EPS的复杂性以及EPS与菌体的相容性，理想的提取方法并未找到。根据前辈们的研究可知主要的提取方法分为化学方法与物理方法，物理方法主要有直接离心法、超声波法、离子交换树脂法、蒸汽法和热提法，而化学方法有硫酸提取法、NaOH提取法、甲醛提取法等。化学方法因为用药品参与分离，所以提取效率非常高，但是容易对基团产生破坏，并且在之后的过程不会发生逆反应变回初始状态，因此药品的加入大幅度改变EPS的性质。对于我们之后的测定不利，而物理方法提取效率虽然低，但是基本不会改变EPS的生物活性，是之后的测定也更准确，因此我们采用物理方法。
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