灵芝酸提取工艺研究（二）
摘要：[目的] 研究灵芝三萜酸的超声提取工艺，获得最优工艺参数。[方法] 利用HPLC法对灵芝酸A、灵芝酸C2进行含量检测，以灵芝酸A、灵芝酸C2的HPLC检测含量作为考察指标，在单因素考察的基础上, 运用响应曲面法以提取时间、料液比、乙醇体积分数进行三因素三水平的Box-Behnken设计作为试验模型，建立回归方程，优化超声提取灵芝酸A、灵芝酸C2的工艺参数。[结果] 灵芝酸A、C2超声提取的最佳工艺参数为提取时间33.81 min、料液比1:32.91 g?mL-1、乙醇体积分数81.40 %。[结论] 采用响应曲面法分析优化灵芝三萜酸单体——灵芝酸A、灵芝酸C2的超声提取工艺，获得的最优工艺参数准确可靠，可作为灵芝三萜酸提取生产的依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 药品及试剂 3
1.1.2 仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 供试液的制备 3
1.2.2 灵芝酸A、C2的HPLC检测方法 3
1.2.3 标准曲线的绘制 3
1.2.4 HPLC法的方法学考察 4
1.2.5 单因素实验设计 4
1.2.6 响应曲面法实验设计 4
2 结果与分析 4
2.1 灵芝酸A、C2的HPLC法检测结果 4
2.1.1 灵芝酸A、C2的标准曲线 4
2.1.2 方法学考察结果 5
2.2 响应曲面法实验结果 6
2.2.1 单因素实验结果 6
2.2.2 多因素实验结果 7
2.2.3 因素交互效应结果 8
2.2.4 工艺条件优化结果 9
2.2.5 回归模型显著性分析结果 9
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
灵芝三萜酸提取工艺研究（二）
引言
灵芝作为中国名贵的传统中药，其药用价值自古以来就在书
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
籍中被记录。但与大多数作为中药的植物不同，灵芝属真菌类，其学名现已订正为Ganoderma lingzhi[1, 2]。现代研究发现，灵芝是多种神奇功效聚于一身，常服用可提高人体抗病能力，包括抗衰老、保肝护肝、降血糖等，显著增强免疫功能[3, 4]。灵芝中含有多种化学成分，如三萜类、多糖类、氨基多肽类、生物碱类、吠喃衍生物等，在这之中，三萜类化合物是具有药理活性的主要成分。药理研究表明，灵芝三萜类物质能够抗肿瘤、抗HIV等 [5]。如灵芝酸A、B(garnoderic acid A, B)等对小鼠肌肉细胞组胺的释放有抑制作用，灵芝酸F(garnoderic acid F)能够抑制血管紧张素酶的活性，赤芝孢子酸A(ganosporeric acid A)能够降低由于CCl4和半乳糖胺及丙酸杆菌造成提高的小鼠转氨酶[68]。
综上我们可以看出灵芝三萜酸对于人体健康的益处，因而灵芝三萜酸提取工艺的研究正逐渐被人们关注起来。研究发现，灵芝三萜酸难溶于水，一般用甲醇、乙醇或氯仿等有机溶剂进行提取[9]。传统的提取方法有浸提法，浸提法提取时不需要加热，使用的溶剂种类多，提取范围广，提取的三萜也较为稳定，提取率重复性好。张宪民等人就确立了以氯仿或丙酮从紫芝中提取三萜类物质的标准化方法[10]。但浸提法的不足之处在于溶剂浸提耗时较长且得率较低，而通过加热回流能够在一定程度上减少提取所耗费的时间，提高提取得率。目前，超声辅助提取技术[11]作为一种新的提取技术应用于灵芝三萜酸，利用超声波粉碎灵芝的致密结构，能够提高灵芝三萜酸得率，相对加热回流法也能够进一步缩短提取时间。除此之外，利用超临界CO2萃取方法[12]提取的灵芝三萜酸不会发生反应而改变活性，绿色、无毒、安全，是目前能够用于规模生产的最先进的分离萃取技术。
对灵芝三萜酸的含量进行检测，能够评价三萜酸提取工艺的优劣。分光光度法是一种快速检测灵芝中总三萜含量的方法[13]，但总三萜包括灵芝三萜酸和少量灵芝醛等其他多环非酸性三萜，应用该法测定的总三萜含量并不能准确代表灵芝三萜酸含量。总三萜成分复杂，各灵芝三萜酸单体的含量需要进行分离检测。当前，高效液相色谱法(HPLC)检测灵芝三萜酸单体的应用最为常见，另外日趋成熟的液质联用(LCMS)技术在灵芝三萜酸的定量研究中也越来越受到重视[14]。来自伊朗的Somayeh Keypour就利用反相高效液相色谱法(RPHPLC)和电喷雾电离质谱(ESIMS)组合，研究分析了伊朗和中国两地的灵芝中所含的灵芝酸成分[15]。
目前，对于灵芝三萜提取工艺的研究常用正交试验法考察各不同因素对灵芝三萜提取工艺的影响[1620]，优化提取工艺。但在已有文献的记录中，采用曲面响应法进行灵芝三萜酸提取工艺的优化[21, 22]比较少有报道。响应曲面法(RSM)是一种通过回归拟合响应值与各因素变量之间函数关系来优化各影响因素参数的统计方法[23]。以实验研究指标作为响应值，对多个实验因素拟合多元二次回归方程，能够考察研究指标在取极值的情况下各实验因素变量的条件。通过该方法优化得到的工艺参数准确可靠，相对传统的正交试验法更为科学，也比较新颖。
本课题在已有文献的基础上，以HPLC法检测灵芝三萜酸单体——灵芝酸A(garnoderic acid A)、灵芝酸C2(garnoderic acid C2)的含量作为研究指标，利用响应曲面法考察提取时间、料液比、乙醇体积分数这三个因素对于超声提取灵芝三萜酸的影响，最终确定灵芝三萜酸超声提取的最佳工艺参数。
材料与方法
材料
药品及试剂
灵芝切片（产地江苏，批号15080102）；灵芝酸A标准品（西宝生物科技（上海）股份有限公司，≥98.0 %）；灵芝酸C2对照标准品（西宝生物科技（上海）股份有限公司，≥98.0 %）；乙腈（南京寿德试验器材有限公司，色谱纯）；甲醇（南京寿德试验器材有限公司，色谱纯）；无水乙醇（南京寿德试验器材有限公司，分析纯）；冰醋酸（南京寿德试验器材有限公司，分析纯）。
仪器
QE250型高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；KQ500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；T500Y型台秤（常熟双杰测试仪器厂）；N1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；SB2000型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；FL2200型高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）；FL2200型高压输液泵（浙江福立分析仪器有限公司）；FL2200型紫外检测器（浙江福立分析仪器有限公司）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 药品及试剂 3
1.1.2 仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 供试液的制备 3
1.2.2 灵芝酸A、C2的HPLC检测方法 3
1.2.3 标准曲线的绘制 3
1.2.4 HPLC法的方法学考察 4
1.2.5 单因素实验设计 4
1.2.6 响应曲面法实验设计 4
2 结果与分析 4
2.1 灵芝酸A、C2的HPLC法检测结果 4
2.1.1 灵芝酸A、C2的标准曲线 4
2.1.2 方法学考察结果 5
2.2 响应曲面法实验结果 6
2.2.1 单因素实验结果 6
2.2.2 多因素实验结果 7
2.2.3 因素交互效应结果 8
2.2.4 工艺条件优化结果 9
2.2.5 回归模型显著性分析结果 9
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
灵芝三萜酸提取工艺研究（二）
引言
灵芝作为中国名贵的传统中药，其药用价值自古以来就在书
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
籍中被记录。但与大多数作为中药的植物不同，灵芝属真菌类，其学名现已订正为Ganoderma lingzhi[1, 2]。现代研究发现，灵芝是多种神奇功效聚于一身，常服用可提高人体抗病能力，包括抗衰老、保肝护肝、降血糖等，显著增强免疫功能[3, 4]。灵芝中含有多种化学成分，如三萜类、多糖类、氨基多肽类、生物碱类、吠喃衍生物等，在这之中，三萜类化合物是具有药理活性的主要成分。药理研究表明，灵芝三萜类物质能够抗肿瘤、抗HIV等 [5]。如灵芝酸A、B(garnoderic acid A, B)等对小鼠肌肉细胞组胺的释放有抑制作用，灵芝酸F(garnoderic acid F)能够抑制血管紧张素酶的活性，赤芝孢子酸A(ganosporeric acid A)能够降低由于CCl4和半乳糖胺及丙酸杆菌造成提高的小鼠转氨酶[68]。
综上我们可以看出灵芝三萜酸对于人体健康的益处，因而灵芝三萜酸提取工艺的研究正逐渐被人们关注起来。研究发现，灵芝三萜酸难溶于水，一般用甲醇、乙醇或氯仿等有机溶剂进行提取[9]。传统的提取方法有浸提法，浸提法提取时不需要加热，使用的溶剂种类多，提取范围广，提取的三萜也较为稳定，提取率重复性好。张宪民等人就确立了以氯仿或丙酮从紫芝中提取三萜类物质的标准化方法[10]。但浸提法的不足之处在于溶剂浸提耗时较长且得率较低，而通过加热回流能够在一定程度上减少提取所耗费的时间，提高提取得率。目前，超声辅助提取技术[11]作为一种新的提取技术应用于灵芝三萜酸，利用超声波粉碎灵芝的致密结构，能够提高灵芝三萜酸得率，相对加热回流法也能够进一步缩短提取时间。除此之外，利用超临界CO2萃取方法[12]提取的灵芝三萜酸不会发生反应而改变活性，绿色、无毒、安全，是目前能够用于规模生产的最先进的分离萃取技术。
对灵芝三萜酸的含量进行检测，能够评价三萜酸提取工艺的优劣。分光光度法是一种快速检测灵芝中总三萜含量的方法[13]，但总三萜包括灵芝三萜酸和少量灵芝醛等其他多环非酸性三萜，应用该法测定的总三萜含量并不能准确代表灵芝三萜酸含量。总三萜成分复杂，各灵芝三萜酸单体的含量需要进行分离检测。当前，高效液相色谱法(HPLC)检测灵芝三萜酸单体的应用最为常见，另外日趋成熟的液质联用(LCMS)技术在灵芝三萜酸的定量研究中也越来越受到重视[14]。来自伊朗的Somayeh Keypour就利用反相高效液相色谱法(RPHPLC)和电喷雾电离质谱(ESIMS)组合，研究分析了伊朗和中国两地的灵芝中所含的灵芝酸成分[15]。
目前，对于灵芝三萜提取工艺的研究常用正交试验法考察各不同因素对灵芝三萜提取工艺的影响[1620]，优化提取工艺。但在已有文献的记录中，采用曲面响应法进行灵芝三萜酸提取工艺的优化[21, 22]比较少有报道。响应曲面法(RSM)是一种通过回归拟合响应值与各因素变量之间函数关系来优化各影响因素参数的统计方法[23]。以实验研究指标作为响应值，对多个实验因素拟合多元二次回归方程，能够考察研究指标在取极值的情况下各实验因素变量的条件。通过该方法优化得到的工艺参数准确可靠，相对传统的正交试验法更为科学，也比较新颖。
本课题在已有文献的基础上，以HPLC法检测灵芝三萜酸单体——灵芝酸A(garnoderic acid A)、灵芝酸C2(garnoderic acid C2)的含量作为研究指标，利用响应曲面法考察提取时间、料液比、乙醇体积分数这三个因素对于超声提取灵芝三萜酸的影响，最终确定灵芝三萜酸超声提取的最佳工艺参数。
材料与方法
材料
药品及试剂
灵芝切片（产地江苏，批号15080102）；灵芝酸A标准品（西宝生物科技（上海）股份有限公司，≥98.0 %）；灵芝酸C2对照标准品（西宝生物科技（上海）股份有限公司，≥98.0 %）；乙腈（南京寿德试验器材有限公司，色谱纯）；甲醇（南京寿德试验器材有限公司，色谱纯）；无水乙醇（南京寿德试验器材有限公司，分析纯）；冰醋酸（南京寿德试验器材有限公司，分析纯）。
仪器
QE250型高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；KQ500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；T500Y型台秤（常熟双杰测试仪器厂）；N1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；SB2000型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；FL2200型高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）；FL2200型高压输液泵（浙江福立分析仪器有限公司）；FL2200型紫外检测器（浙江福立分析仪器有限公司）。
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