刀鲚乙二醛酶i基因的cdna全长克隆
利用RT-PCR同源克隆的方法及RACE 技术，获得刀鲚(Coilia nasus)乙二醛酶I基因（glyoxalase I）的cDNA全长；克隆了GLOI的cDNA，并分析了其结构特征。研究结果表明，刀鲚GIOL基因的cDNA 全1035bp，编码区549bp，编码182个氨基酸。二级结构预测显示，刀鲚GLOI具有GLOI家族的典型结构域。氨基酸多重对比显示其序列相似度高达86%。以上研究结果表明，刀鲚GLOI基因的关键功能区高度保守，推测该基因的功能也具有高度保守性。本研究获得了刀鲚GLOI基因的cDNA全长并分析了其结构特点，为评估刀鲚GLOI基因的生长和抗应激遗传育种潜力提供了前期基础资料。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 实验鱼 2
1.1.2 菌株和克隆质粒 2
1.1.3 试剂和试剂盒 2
1.1.4 实验器材 2
1.2 方法 2
1.2.1 总RNA的提取 2
1.2.2 RNA的检测 3
1.2.3 RNA的反转录 3
1.2.4 PCR扩增 3
1.2.5 目的基因片段的回收 4
1.2.6 已知序列验证 4
1.2.7 设计特异性引物 4
1.2.8 连接载体及转化 5
1.3 核酸及氨基酸序列分析 5
2 结果与分析 5
2.1 刀鲚GLOI基因的 cDNA 全长序列及分析 5
2.2 刀鲚GLOI的同源性分析 6
2.3 进化树分析 7
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
刀鲚乙二醛酶I基因的cDNA全长克隆
引言
引言
刀鲚(Coilia nasus) 俗称刀鱼，又名长颌鲚，隶属于鲱形目(Clupeiformes) 、鳀 科(Engraulidae)、鲚属(Coilia)，是我国重 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
要的洄游性经济鱼类之一[1]。主要分布于我国的黄海、渤海、东海一带，沿岸各通海江河如长江、钱塘江、黄河、淮河，辽河等也均有分布[2]。刀鲚因其肉质鲜嫩可口，EPA和DHA含量丰富，摘得长江三鲜之首的美誉。
历史上刀鲚资源丰富，但自从20世纪70年代以来水域遭到污染、水文条件改变、刀鲚产卵场遭到破坏，再加上清明节左右对刀鲚的需求量巨大，导致捕捞强度不断上升，使得刀鲚资源短缺，甚至很多地方已经难以形成渔讯[3]。据调查，发现相比早年的长江刀鲚，目前刀鲚不仅肉质鲜美程度明显下降，且体内残毒含量显著增加[4]。资源短缺导致物价高升，物价升高就意味着加大捕捞强度，捕捞强度又会致使资源紧张，反复恶性循环，如今刀鲚已经成为珍贵鱼种之一，刀鲚的人工养殖及繁殖技术已迫在眉睫。
从2003年张呈祥等[6]采用“灌江纳苗”的方法成功进行了刀鲚的池塘养殖后，陆续幼鱼采捕、人工繁殖，苗种培育技术等试验成功，不仅缓解了一定程度上的需求，也使得刀鲚池塘养殖变成了一种新兴产业[7]。但是这并没有完全解决问题，刀鲚对环境有一定的应激反应致使其存活率不高，导致应激反应的因素不是很明确，应激反应对动物体有破坏作用，即所谓的适应性疾病。当动物处于应激状态时，下丘脑垂体肾上腺皮质系统活动增强，诱导糖类分解代谢，代谢过程产生糖基化终末产物，对细胞产生毒性，造成组织损伤。乙二醛酶具有代谢糖基化终末产物的功能，因此推测乙二醛酶I基因在应激反应中起得重要的作用。
乙二醛酶I（glyoxalase I）基因存在于生物体不同位置，它是乙二醛酶重要组成部分之一，不同生物体其结构略有不同。于1913年被Neberg与Dokin[7]发现的，他们发现生物体内可将甲基乙二醛转变为乳酸这个现象，于是将其催化此反应的酶称为乙二醛酶，而催化甲基乙二醛转变为乳酸的酶是由二个不同的酶所组成的酶系。按催化反应的顺序，将这二种酶分别称为乙二醛酶I(EC4,4,1,5)与乙二醛酶II(EC3,1,2,6)[7]。
乙二醛酶I的天然活性底物为(酮基醛类物质，能够将其转化为对细胞无害的(羟基酸等物质，在细胞中发挥着重要的解毒功能[8]。另外，乙二醛酶I通过催化(酮基醛类物质反应，还对细胞周期细胞生长具有重要的调节功能关乙二醛酶的基因结构[9]、酶活性及作用机理研究已在高等动物中广泛展开，其与炎症反应、血管病变等多种疾病的相关性分析也有一些报道[10]。
除这些之外，乙二醛酶还可通过转变(酮基醛类化合物对蛋白质合成和细胞分的抑制，来参与细胞周期的调节,实现调控细胞生长，细胞增殖等功能，Kurz等[11]发现通过抑制乙二醛酶的活性，可抑制肿瘤细胞生长；隋龙等[12]研究结果表明乙二醛酶I基因的过量表达可明显促进子宫内膜癌细胞系Ishikwa细胞增殖，并抑制其细胞凋亡，证明乙二醛酶对调节细胞生长具有重要作用；郑秀琴等[13]研究发现乙二醛酶对神经元细胞的发育具有重要作用。
目前国内外尚未展开刀鲚乙二醛酶I基因的相关研究，本研究首次克隆了刀鲚乙二醛酶I基因，为评估其抗应激遗传育种潜力提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验鱼
刀鲚取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地，室内水泥池驯养。共取20尾，体长120±2.0㎜，体重8.5±2.0g。分别解剖，取出肝脏、肌肉、肠、脑、心脏、肾脏等组织，编号后放入液氮中速冻，然后于80°C冰箱中保存用于提取RNA。
1.1.2 菌株和克隆质粒
感受态大肠杆菌DH5a，PMD18T载体。
1.1.3 试剂和试剂盒
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、SMART RACE试剂盒、RNAiso Plus、TaKaRa RNA PGR Kit(AMV)3.0、TaKaRa LA Taq、DNAMarkerDL2000、氨青霉素、pMD18T Vector基因组DNA提取试剂。
1.1.4 实验器材
80 °C超低温冷冻冰箱、微量移液器、超净工作台、台式离心机、PCR 仪、电热恒温水浴锅，水平摇床。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取
（1）将备用组织加入适量RNAiso Plus，弄匀浆液（暂不用，30°C保存）。
（2）取400μL匀浆，加RNAiso Plus至1ml。
（3）加入1/5 体积RNAiso Plus约200μL氯仿振荡混匀，室温静置5min，12000×g，4°C离心15min。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 实验鱼 2
1.1.2 菌株和克隆质粒 2
1.1.3 试剂和试剂盒 2
1.1.4 实验器材 2
1.2 方法 2
1.2.1 总RNA的提取 2
1.2.2 RNA的检测 3
1.2.3 RNA的反转录 3
1.2.4 PCR扩增 3
1.2.5 目的基因片段的回收 4
1.2.6 已知序列验证 4
1.2.7 设计特异性引物 4
1.2.8 连接载体及转化 5
1.3 核酸及氨基酸序列分析 5
2 结果与分析 5
2.1 刀鲚GLOI基因的 cDNA 全长序列及分析 5
2.2 刀鲚GLOI的同源性分析 6
2.3 进化树分析 7
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
刀鲚乙二醛酶I基因的cDNA全长克隆
引言
引言
刀鲚(Coilia nasus) 俗称刀鱼，又名长颌鲚，隶属于鲱形目(Clupeiformes) 、鳀 科(Engraulidae)、鲚属(Coilia)，是我国重 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
要的洄游性经济鱼类之一[1]。主要分布于我国的黄海、渤海、东海一带，沿岸各通海江河如长江、钱塘江、黄河、淮河，辽河等也均有分布[2]。刀鲚因其肉质鲜嫩可口，EPA和DHA含量丰富，摘得长江三鲜之首的美誉。
历史上刀鲚资源丰富，但自从20世纪70年代以来水域遭到污染、水文条件改变、刀鲚产卵场遭到破坏，再加上清明节左右对刀鲚的需求量巨大，导致捕捞强度不断上升，使得刀鲚资源短缺，甚至很多地方已经难以形成渔讯[3]。据调查，发现相比早年的长江刀鲚，目前刀鲚不仅肉质鲜美程度明显下降，且体内残毒含量显著增加[4]。资源短缺导致物价高升，物价升高就意味着加大捕捞强度，捕捞强度又会致使资源紧张，反复恶性循环，如今刀鲚已经成为珍贵鱼种之一，刀鲚的人工养殖及繁殖技术已迫在眉睫。
从2003年张呈祥等[6]采用“灌江纳苗”的方法成功进行了刀鲚的池塘养殖后，陆续幼鱼采捕、人工繁殖，苗种培育技术等试验成功，不仅缓解了一定程度上的需求，也使得刀鲚池塘养殖变成了一种新兴产业[7]。但是这并没有完全解决问题，刀鲚对环境有一定的应激反应致使其存活率不高，导致应激反应的因素不是很明确，应激反应对动物体有破坏作用，即所谓的适应性疾病。当动物处于应激状态时，下丘脑垂体肾上腺皮质系统活动增强，诱导糖类分解代谢，代谢过程产生糖基化终末产物，对细胞产生毒性，造成组织损伤。乙二醛酶具有代谢糖基化终末产物的功能，因此推测乙二醛酶I基因在应激反应中起得重要的作用。
乙二醛酶I（glyoxalase I）基因存在于生物体不同位置，它是乙二醛酶重要组成部分之一，不同生物体其结构略有不同。于1913年被Neberg与Dokin[7]发现的，他们发现生物体内可将甲基乙二醛转变为乳酸这个现象，于是将其催化此反应的酶称为乙二醛酶，而催化甲基乙二醛转变为乳酸的酶是由二个不同的酶所组成的酶系。按催化反应的顺序，将这二种酶分别称为乙二醛酶I(EC4,4,1,5)与乙二醛酶II(EC3,1,2,6)[7]。
乙二醛酶I的天然活性底物为(酮基醛类物质，能够将其转化为对细胞无害的(羟基酸等物质，在细胞中发挥着重要的解毒功能[8]。另外，乙二醛酶I通过催化(酮基醛类物质反应，还对细胞周期细胞生长具有重要的调节功能关乙二醛酶的基因结构[9]、酶活性及作用机理研究已在高等动物中广泛展开，其与炎症反应、血管病变等多种疾病的相关性分析也有一些报道[10]。
除这些之外，乙二醛酶还可通过转变(酮基醛类化合物对蛋白质合成和细胞分的抑制，来参与细胞周期的调节,实现调控细胞生长，细胞增殖等功能，Kurz等[11]发现通过抑制乙二醛酶的活性，可抑制肿瘤细胞生长；隋龙等[12]研究结果表明乙二醛酶I基因的过量表达可明显促进子宫内膜癌细胞系Ishikwa细胞增殖，并抑制其细胞凋亡，证明乙二醛酶对调节细胞生长具有重要作用；郑秀琴等[13]研究发现乙二醛酶对神经元细胞的发育具有重要作用。
目前国内外尚未展开刀鲚乙二醛酶I基因的相关研究，本研究首次克隆了刀鲚乙二醛酶I基因，为评估其抗应激遗传育种潜力提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验鱼
刀鲚取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地，室内水泥池驯养。共取20尾，体长120±2.0㎜，体重8.5±2.0g。分别解剖，取出肝脏、肌肉、肠、脑、心脏、肾脏等组织，编号后放入液氮中速冻，然后于80°C冰箱中保存用于提取RNA。
1.1.2 菌株和克隆质粒
感受态大肠杆菌DH5a，PMD18T载体。
1.1.3 试剂和试剂盒
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、SMART RACE试剂盒、RNAiso Plus、TaKaRa RNA PGR Kit(AMV)3.0、TaKaRa LA Taq、DNAMarkerDL2000、氨青霉素、pMD18T Vector基因组DNA提取试剂。
1.1.4 实验器材
80 °C超低温冷冻冰箱、微量移液器、超净工作台、台式离心机、PCR 仪、电热恒温水浴锅，水平摇床。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取
（1）将备用组织加入适量RNAiso Plus，弄匀浆液（暂不用，30°C保存）。
（2）取400μL匀浆，加RNAiso Plus至1ml。
（3）加入1/5 体积RNAiso Plus约200μL氯仿振荡混匀，室温静置5min，12000×g，4°C离心15min。
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