养殖环境中携带ahllactonase基因菌株筛选
细菌的群体感应（quorum sensing, QS）是一种化学信号浓度依赖性调控机制，与病原菌的毒力基因表达、生物膜形成、生物发光等有密切关系。自然界中天然存在一些能分泌降解病原菌QS化学物质的菌株，为疾病防控提供了非常有效的手段。嗜水气单胞菌是淡水养殖中危害非常严重的条件性致病菌，研究证实其群感效应通过酰基高丝氨酸内酯（AHL）进行调控。本文以酰基高丝氨酸内酯降解酶基因通用引物PCR检测的方法从养殖环境中分离和筛携带AHL-Lactonase基因的菌株。初步从320菌株中筛选到1株（编号51）PCR结果为阳性，基于细菌生化反应特征和16S rRNA 序列分析，将其鉴定为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1细菌来源2
1.2主要试剂和实验仪器2
1.3样品处理3
1.3.1采样和细菌的分离3
1.3.2细菌保存3
1.3.3 PCR初筛3
1.4 16SrRNA基因序列测定3
1.4.1模板DNA的制备3
1.4.2序列分析 3
1.5生理生化鉴定 3
2结果与分析4
2.1实验结果4
2.1.1菌落形态特征4
2.1.2 生理生化特征4
2.1.3 PCR扩增及16SrRNA PCR产物序列测定5
2.2系统发育分析6
3讨论 7
3.1蜡样芽孢杆菌的特性、检测方法 7
3.2细菌群体感应的研究热点7
3.3存在的问题及今后的研究方向7
致谢8
参考文献8
养殖环境中携带AHLLactonase基因菌株的筛选
引言
引言
20世纪90年代,有研究发现大多数细菌会低水平地合成并分泌一种被称为自诱导物的小分子信号分子,细菌通过这些信号分子进行信息的交流和协调群体行为[2]。不同种类细菌分泌的自动诱导分子存 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
在差异，按照自体诱导信号分子的性质以及感应模式，将细菌QS 信息系统分为以下类型[3]：(1)革兰氏阴性菌的LuxR/I 型信息系统；(2)革兰氏阳性菌中寡肽介导的信息系统；(3)LuxS/AI2 型的信息系统；(4)AI3/ 肾上腺素/ 去甲肾上腺素信息系统。近年来，研究人员陆续在芽孢杆菌、霍乱弧菌等细菌中发现了与细菌的群体感应相关的一些蛋白[4]。有研究者通过构建一个由自身诱导肽、受体激酶和反应调节子构成的保守群体感应基因盒,利用PCR方法从链球菌,梭状芽孢杆菌和乳糖菌等菌种中扩增出很多与群体感应相关的基因，这种高通量的研究方法有助于研究不同种群间信号分子的功能[5]。利用特征标记突变法和高通量筛选法研究铜绿假单胞菌突变株对小鼠模型的感染力的实验结果表明,在菌株生长稳定期后期,有222个基因与之无关,450个基因受群体感应影响[6]。目前对群体感应的了解还很有限，还不能将群体感应机制全方面的用于生物技术领域中。要想全方位开发其应用价值,还需要加强对群体感应机制各方面的研究。
细菌群体感应研究具有十分重要的理论意义和现实意义。我们可以运用生物药剂阻断群体感应,通过干扰细菌的群体感应系统以减弱动植物病菌的致病性，如群体感应系统抑制物在污水生物处理中的应用对于控制生物膜淤积、维持 MBＲs 长效性，通过 AHL酰基转移酶降解 AHL 型群体感应信号分子，可使生物淤积得到有效抑制[78]，等等。微生物群体感应系统的调节机制已在医药学、农业和环境领域获得应用。目前发现的大多数革兰氏阴性细菌以N酰基高丝氨酸内酯(Acyl homoserine lactone,简称AHL)类物质作为信号分子[2]，淡水养殖中危害最严重条件性致病菌—嗜水气单胞菌，就是此类细菌。而本课题是以具有降解这种信号分子能力的细菌作为筛选对象，以期筛选到携带AHLLactonase基因的细菌，并培养成为细菌株保存下来，为细菌性鱼病的研究提供原材料。从生物技术角度出发,人们更期望筛选、鉴定出更多的能够降解AHL的微生物,进而开发设计生物性高效抗菌剂。
1 取样和方法
1.1 细菌的来源
采集自养殖鱼塘的底泥，养殖鱼塘水，养殖鱼体。
1.2 主要试剂和实验器材
从3个生态位点分离细菌同时采用适用于不同细菌类群的培养基。
(1)非选择性的（但也不能保证所有种类菌都能长处，如厌氧的，由于营养竞争、生长缓慢的）：营养琼脂、LB。
(2)肠杆菌选择性：（只用于做肠道样品） 麦康凯/ 月桂基磺酸盐蛋白胨肉汤(LST)。
(3)芽孢杆菌选择性（Bacillus）（样品涂布前80度加热20分钟）：芽孢杆菌选择培养基配方详见表11。
表11 芽孢杆菌选择培养基配方
Bacillus Medium(g/L)*
蛋白胨Peptone 10
酵母提取物Yeast extract 3
淀粉 Starch 3
MgSO4 0.1
KH2PO4 1.5
Na2HPO4 50
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1细菌来源2
1.2主要试剂和实验仪器2
1.3样品处理3
1.3.1采样和细菌的分离3
1.3.2细菌保存3
1.3.3 PCR初筛3
1.4 16SrRNA基因序列测定3
1.4.1模板DNA的制备3
1.4.2序列分析 3
1.5生理生化鉴定 3
2结果与分析4
2.1实验结果4
2.1.1菌落形态特征4
2.1.2 生理生化特征4
2.1.3 PCR扩增及16SrRNA PCR产物序列测定5
2.2系统发育分析6
3讨论 7
3.1蜡样芽孢杆菌的特性、检测方法 7
3.2细菌群体感应的研究热点7
3.3存在的问题及今后的研究方向7
致谢8
参考文献8
养殖环境中携带AHLLactonase基因菌株的筛选
引言
引言
20世纪90年代,有研究发现大多数细菌会低水平地合成并分泌一种被称为自诱导物的小分子信号分子,细菌通过这些信号分子进行信息的交流和协调群体行为[2]。不同种类细菌分泌的自动诱导分子存 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
在差异，按照自体诱导信号分子的性质以及感应模式，将细菌QS 信息系统分为以下类型[3]：(1)革兰氏阴性菌的LuxR/I 型信息系统；(2)革兰氏阳性菌中寡肽介导的信息系统；(3)LuxS/AI2 型的信息系统；(4)AI3/ 肾上腺素/ 去甲肾上腺素信息系统。近年来，研究人员陆续在芽孢杆菌、霍乱弧菌等细菌中发现了与细菌的群体感应相关的一些蛋白[4]。有研究者通过构建一个由自身诱导肽、受体激酶和反应调节子构成的保守群体感应基因盒,利用PCR方法从链球菌,梭状芽孢杆菌和乳糖菌等菌种中扩增出很多与群体感应相关的基因，这种高通量的研究方法有助于研究不同种群间信号分子的功能[5]。利用特征标记突变法和高通量筛选法研究铜绿假单胞菌突变株对小鼠模型的感染力的实验结果表明,在菌株生长稳定期后期,有222个基因与之无关,450个基因受群体感应影响[6]。目前对群体感应的了解还很有限，还不能将群体感应机制全方面的用于生物技术领域中。要想全方位开发其应用价值,还需要加强对群体感应机制各方面的研究。
细菌群体感应研究具有十分重要的理论意义和现实意义。我们可以运用生物药剂阻断群体感应,通过干扰细菌的群体感应系统以减弱动植物病菌的致病性，如群体感应系统抑制物在污水生物处理中的应用对于控制生物膜淤积、维持 MBＲs 长效性，通过 AHL酰基转移酶降解 AHL 型群体感应信号分子，可使生物淤积得到有效抑制[78]，等等。微生物群体感应系统的调节机制已在医药学、农业和环境领域获得应用。目前发现的大多数革兰氏阴性细菌以N酰基高丝氨酸内酯(Acyl homoserine lactone,简称AHL)类物质作为信号分子[2]，淡水养殖中危害最严重条件性致病菌—嗜水气单胞菌，就是此类细菌。而本课题是以具有降解这种信号分子能力的细菌作为筛选对象，以期筛选到携带AHLLactonase基因的细菌，并培养成为细菌株保存下来，为细菌性鱼病的研究提供原材料。从生物技术角度出发,人们更期望筛选、鉴定出更多的能够降解AHL的微生物,进而开发设计生物性高效抗菌剂。
1 取样和方法
1.1 细菌的来源
采集自养殖鱼塘的底泥，养殖鱼塘水，养殖鱼体。
1.2 主要试剂和实验器材
从3个生态位点分离细菌同时采用适用于不同细菌类群的培养基。
(1)非选择性的（但也不能保证所有种类菌都能长处，如厌氧的，由于营养竞争、生长缓慢的）：营养琼脂、LB。
(2)肠杆菌选择性：（只用于做肠道样品） 麦康凯/ 月桂基磺酸盐蛋白胨肉汤(LST)。
(3)芽孢杆菌选择性（Bacillus）（样品涂布前80度加热20分钟）：芽孢杆菌选择培养基配方详见表11。
表11 芽孢杆菌选择培养基配方
Bacillus Medium(g/L)*
蛋白胨Peptone 10
酵母提取物Yeast extract 3
淀粉 Starch 3
MgSO4 0.1
KH2PO4 1.5
Na2HPO4 50
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