中华绒螯蟹促雄性腺igfbp与iag相互作用的酵母双杂交实验
促雄性腺（AG）是甲壳动物中特有的雄性内分泌器官，对甲壳动物的雄性性征维持和性别分化发挥着重要作用，AG的作用主要通过分泌促雄性腺激素（IAG）来实现。在此次的实验中我们着重关注在中华绒螯蟹中胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）和IAG之间有无相互作用。我们从中华绒螯蟹中利用RACE PCR的方法克隆得到了长度为889bp，编码266个氨基酸的IGFBP的全长cDNA序列。并用实时定量荧光PCR的方法从9个器官中获得了该基因的表达谱。用酵母双杂交的方法证明了IGFBP与IAG这两种基因的产物的确存在相互作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 IGFBP基因cDNA序列的RACE克隆 2
1．1．1 mRNA的提取和反转录 2
1．1．2 IGFBP cDNA序列的分析和cds的克隆 2
1．2 IGFBP基因表达谱的建立 2
1．3 IGFBP与IAG的酵母双杂实验 2
1．3．1 重组质粒的构建 2
1．3．2 酵母双杂实验 3
2 结果与分析 3
2．1 IGFBP基因cDNA片段的克隆 3
2．2 IGFBP基因的表达谱 5
2．3 IGFBP与IAG的酵母双杂实验 5
3 讨论 6
致谢 7
参考文献： 7
中华绒螯蟹促雄性腺IGFBP与IAG相互作用的酵母双杂交实验
引言
引言
促雄性腺(AG)，是高等甲壳类动物独有的内分泌腺体，在控制雄性性别分化，维持雄性的第二性征方面具有重要的作用。自从它在1947年被Cronin在蓝蟹中发现[1],它的控制雄性性征的功能在几年后被人在跳沟虾中阐明[2]。此后，也在其他的等脚类或十足目中发现其功能，人们做了大量的促雄性腺的移植和摘除实验，证明在个体生长某一阶段促雄性腺的摘除和移植会分别引起雄雌之间的性反转。直到现在，人们普遍认为雄性的性别分化由促雄性腺控制。而它所分泌的促雄性腺激素(AGH)是目 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
前甲壳动物中发现的唯一的雄性激素。在1999年，在等足类的甲壳动物的寻常平甲虫中分离到了AGH的纯品[3]，其活性成分被证明是一种具有两个肽链的糖蛋白[4]。但是AGH至今都没有在十足目个体中被分离出来[5]。在2007年，有人用cDNA差减文库的方法在红鳌鳌虾中获得了在AG 中特异表达的基因，因为其序列与胰岛素基因较为类似，故命名为类胰岛素促雄性腺因子（IAG）[6]。由于IAG与类胰岛素生长因子（IGF）基因很像，具有相同的保守结构。而IGF被证明会与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）相互结合，所以我们猜测IAG与IGFBP会发生作用[7]。在2014年，以色列科学家在东方岩龙虾中发现了IAG可以与IGFBP相互作用[8]。为研究甲壳动物AG的功能通路发现了新的线索。所以，在中华绒螯蟹中，我们要验证IAG是否会与IGFBP相互作用。这对于弄清IAG的表达和它的的蛋白产物是如何发挥调控作用的具有重要的意义，为中华绒螯蟹的单性养殖提供了理论基础。
此次试验中利用的酵母双杂交系统是由Fields和Song等在研究真核基因转录调控的过程中建立的，典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有两个不同的结构域：DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。前者可识别DNA上的特异序列，使得AD定位于所调节基因的上游，这样AD便可以同转录复合体的其他成分作用，启动被调节基因的转录。我们将要研究的两种蛋白分别与AD和BD链接到一起，如果两种蛋白相互作用，AD与BD两者相互靠近，则被调控基因转录表达，使得酵母细菌能在营养缺陷的培养基上生长。我们此次利用的pGBKT7质粒具有BD结构域的基因，pGADT7质粒具有AD结构域基因。将两种目标蛋白的基因片段分别导入两种质粒当中，并将两种质粒同时导入酵母当中，涂布于营养缺陷的培养基上，观察其生长情况。
1 材料与方法
1．1 IGFBP基因cDNA片段的克隆
1．1．1 mRNA的提取和反转录 从养殖场获得成年雌性和雄性中华绒螯蟹，在室温环境下（水温15℃20℃）水族箱中驯养一个星期。用低温法麻痹螃蟹，取其精巢(TE)、卵巢(OV)、促雄性腺（AG）、副性腺（AS）、肌肉（MU）、心脏（HEA）、肝胰腺（HE）、鳃（GI）和小肠（IN）这九种适量组织，利用Takara RNA Kit提取这些组织的mRNA并用DNA酶处理。具体方法是：2μg RNA，1μl 10×DNase Buffer, 1μl DNase, 0.5μl RNase Inhibitor在37℃下反应30min，再加入1μl RQ Stop在65℃下10min终止反应并变性。再加入4μl 5% Reaction Buffer, 2μl oligo(dt), 2μl dNTPs, 0.5μl RNase Inhibitor, 1μl MMRT酶在42℃下延伸2小时，在70℃下5min失活，得到总cDNA。
1．1．2 IGFBP基因cDNA序列的分析和cds的克隆 由于在本实验之前的高通量测序已知了IGFBP基因的cDNA中间的一段序列，所以在此基础之上我们设计出用于5’和3’RACE PCR的引物（表1），进行PCR的扩增（94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s,循环35次）获得5’端和3’端序列并检测，最终得到IGFBP的cDNA全部的序列信息。并利用DNAman软件和NCBI Blast分析该序列编码的氨基酸序列和有关结构域的信息。并设计出引物扩增出IGFBP基因的cds片段。
1．2 IGFBP基因表达谱的建立
利用设计出的es.igfbp.f和es.igfbp.r两种引物（表1），以es.betaactinf和es.betaactinr两种引物作为内参，以提取的九种器官中的mRNA转录的cDNA进行Realtime PCR(检测好mRNA浓度作为参照),最终得到了IGFBP基因在这九种组织当中的表达谱。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 IGFBP基因cDNA序列的RACE克隆 2
1．1．1 mRNA的提取和反转录 2
1．1．2 IGFBP cDNA序列的分析和cds的克隆 2
1．2 IGFBP基因表达谱的建立 2
1．3 IGFBP与IAG的酵母双杂实验 2
1．3．1 重组质粒的构建 2
1．3．2 酵母双杂实验 3
2 结果与分析 3
2．1 IGFBP基因cDNA片段的克隆 3
2．2 IGFBP基因的表达谱 5
2．3 IGFBP与IAG的酵母双杂实验 5
3 讨论 6
致谢 7
参考文献： 7
中华绒螯蟹促雄性腺IGFBP与IAG相互作用的酵母双杂交实验
引言
引言
促雄性腺(AG)，是高等甲壳类动物独有的内分泌腺体，在控制雄性性别分化，维持雄性的第二性征方面具有重要的作用。自从它在1947年被Cronin在蓝蟹中发现[1],它的控制雄性性征的功能在几年后被人在跳沟虾中阐明[2]。此后，也在其他的等脚类或十足目中发现其功能，人们做了大量的促雄性腺的移植和摘除实验，证明在个体生长某一阶段促雄性腺的摘除和移植会分别引起雄雌之间的性反转。直到现在，人们普遍认为雄性的性别分化由促雄性腺控制。而它所分泌的促雄性腺激素(AGH)是目 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
前甲壳动物中发现的唯一的雄性激素。在1999年，在等足类的甲壳动物的寻常平甲虫中分离到了AGH的纯品[3]，其活性成分被证明是一种具有两个肽链的糖蛋白[4]。但是AGH至今都没有在十足目个体中被分离出来[5]。在2007年，有人用cDNA差减文库的方法在红鳌鳌虾中获得了在AG 中特异表达的基因，因为其序列与胰岛素基因较为类似，故命名为类胰岛素促雄性腺因子（IAG）[6]。由于IAG与类胰岛素生长因子（IGF）基因很像，具有相同的保守结构。而IGF被证明会与胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）相互结合，所以我们猜测IAG与IGFBP会发生作用[7]。在2014年，以色列科学家在东方岩龙虾中发现了IAG可以与IGFBP相互作用[8]。为研究甲壳动物AG的功能通路发现了新的线索。所以，在中华绒螯蟹中，我们要验证IAG是否会与IGFBP相互作用。这对于弄清IAG的表达和它的的蛋白产物是如何发挥调控作用的具有重要的意义，为中华绒螯蟹的单性养殖提供了理论基础。
此次试验中利用的酵母双杂交系统是由Fields和Song等在研究真核基因转录调控的过程中建立的，典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有两个不同的结构域：DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。前者可识别DNA上的特异序列，使得AD定位于所调节基因的上游，这样AD便可以同转录复合体的其他成分作用，启动被调节基因的转录。我们将要研究的两种蛋白分别与AD和BD链接到一起，如果两种蛋白相互作用，AD与BD两者相互靠近，则被调控基因转录表达，使得酵母细菌能在营养缺陷的培养基上生长。我们此次利用的pGBKT7质粒具有BD结构域的基因，pGADT7质粒具有AD结构域基因。将两种目标蛋白的基因片段分别导入两种质粒当中，并将两种质粒同时导入酵母当中，涂布于营养缺陷的培养基上，观察其生长情况。
1 材料与方法
1．1 IGFBP基因cDNA片段的克隆
1．1．1 mRNA的提取和反转录 从养殖场获得成年雌性和雄性中华绒螯蟹，在室温环境下（水温15℃20℃）水族箱中驯养一个星期。用低温法麻痹螃蟹，取其精巢(TE)、卵巢(OV)、促雄性腺（AG）、副性腺（AS）、肌肉（MU）、心脏（HEA）、肝胰腺（HE）、鳃（GI）和小肠（IN）这九种适量组织，利用Takara RNA Kit提取这些组织的mRNA并用DNA酶处理。具体方法是：2μg RNA，1μl 10×DNase Buffer, 1μl DNase, 0.5μl RNase Inhibitor在37℃下反应30min，再加入1μl RQ Stop在65℃下10min终止反应并变性。再加入4μl 5% Reaction Buffer, 2μl oligo(dt), 2μl dNTPs, 0.5μl RNase Inhibitor, 1μl MMRT酶在42℃下延伸2小时，在70℃下5min失活，得到总cDNA。
1．1．2 IGFBP基因cDNA序列的分析和cds的克隆 由于在本实验之前的高通量测序已知了IGFBP基因的cDNA中间的一段序列，所以在此基础之上我们设计出用于5’和3’RACE PCR的引物（表1），进行PCR的扩增（94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s,循环35次）获得5’端和3’端序列并检测，最终得到IGFBP的cDNA全部的序列信息。并利用DNAman软件和NCBI Blast分析该序列编码的氨基酸序列和有关结构域的信息。并设计出引物扩增出IGFBP基因的cds片段。
1．2 IGFBP基因表达谱的建立
利用设计出的es.igfbp.f和es.igfbp.r两种引物（表1），以es.betaactinf和es.betaactinr两种引物作为内参，以提取的九种器官中的mRNA转录的cDNA进行Realtime PCR(检测好mRNA浓度作为参照),最终得到了IGFBP基因在这九种组织当中的表达谱。
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