长江刀鲚热休克蛋白hsp90基因的克隆与表达分析
刀鲚为我国长江中重要的经济洄游性鱼类。近年来刀鲚天然产量急剧下降，该物种的生物资源正面临濒危的境地。热休克蛋白在提高细胞对应激的耐受性及维护细胞自稳等方面具有重要的生物学功能。目前关于Hsp的性质、功能和测定方法方面的研究较多。Hsps蛋白在精子发生时起重要作用，同时还能保护精子免受环境中一些不利因子的影响。因此，本研究对刀鲚的HSP90基因全长进行了克隆，对其在刀鲚各组织定位的表达谱进行了分析，并利用免疫组化等学手段对该蛋白在精巢内各个精子发生阶段进行了定位研究，为相关淡水鱼类的生殖生物学提供参考资料。
目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料及数据来源 2
1.2 总RNA的提取 2
1.3 cDNA第一链的合成 3
1.4 目的片段的获得 3
1.5 PCR 产物回收纯化与克隆测序 4
1.6 基因片段序列分析 4
1.7 基因表达谱分析 4
1.7.1 RTPCR 4
1.7.2 qRTPCR分析 4
1.8 数据统计分析 5
2 结果与分析 5
2.1 HSP90 cDNA的特性 5
2.2 HSP90的表达模式分析 7
2.3 HSP90表达模式与刀鲚精巢发育的关系 8
3 结论 8
4 讨论 8
致谢 9
参考文献： 9
长江刀鲚热休克蛋白HSP90基因的克隆与表达分析
引言
热休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)是从原核生物到真核生物普遍存在的一种高度保守的蛋白质。在提高细胞对应激的耐受性及维护细胞自稳等方面具有重要的生物学功能［13]，对维持机体的稳定也发挥着重要作用，目前已成为当今世界生命科学研究领域的热点。最早关于HSP的研究是Ritossa[4]于1962年在试验中发现,将果蝇幼虫的饲养温度由25℃提高至30℃,30 min后,其唾液腺染色体上出现了特殊的“膨 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
突”。Tissieres[5]于1974年证实发生这种现象的原因是因为这个过程中产生了一系列分子量为70 kDa和26 kDa的蛋白质,这些蛋白质被命名为热休克蛋白质。依其分子量的大小及同源程度分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量热休克蛋白[3]。HSP90是HSPs家族中重要成员之一,除具有稳定蛋白质结构、参与细胞周期调控的作用,还在各种疾病的治疗中发挥重要作用,如应激损伤、肿瘤、自身免疫性等疾病[69]，适量HSP90的存在对维持动物正常生长发育是必需的[10]。在细胞发生应激反应时，HSP90可与因环境刺激而使自身构象发生改变的蛋白相互作用，保证蛋白进行适当的折叠并防止蛋白非特异性聚集，增强动物对环境刺激的适应能力。
HSP90是一个无处不在的，高度保守的蛋白质，即使在非胁迫条件下也占细胞总蛋白的2%。它有大量折叠活动的各种受体蛋白。HSP90相互作用蛋白的种类已经增长到近300种蛋白质，并且这些蛋白质的种类数量会继续增长。HSP90是由各种活性的相互作用调制的活动，它可以作为ATP酶活性的调节，影响受体的选择，为目标受体的蛋白质降解，招募其他的分子伴侣，或影响的细胞定位[1821]。在人类和小鼠中，有两种胞质HSP90亚型，由两个独立的基因编码。他们有85.8%的同源性和93.4%的相似性，该两种异构体高度同源[11]。
HSP90在细胞正常代谢过程中负责蛋白的折叠、组装、转运和降解；当机体受到环境胁迫或有害刺激时，会诱导热休克蛋白的表达，稳定蛋白和膜结构，并协助蛋白再折叠，最终维持细胞稳态。大量研究已证明热休克蛋白普遍作用于生物热应激反应，发生作用的基因与诱导条件因物种不同而存在差异。早期研究大多数建立在蛋白质电泳与放射自显影技术基础上，检测到的热休克蛋白按照分子量大小分属于不同基因家族；近年来，研究热点主要集中在特定应激条件下相关热休克蛋白的表达与编码基因的作用机理研究等方面。热休克蛋白90是HSP家族中重要成员之一，除具有稳定蛋白质结构、参与细胞周期调控的作用，还在应激损伤、肿瘤、自身免疫性等疾病治疗中发挥重要作用。
刀鲚，又称长颌鲚，俗称刀鱼，隶属鲱形目，鲱科，鲚属。我国长江中下游地区分布的的刀鲚最早是Jorden和Seale于1905年根据上海标本命名的一个物种。刀鲚是一种溯河洄游性鱼类，平时生活在中国、日本和朝鲜沿海，春季性成熟后从河口溯江而上进入江、湖中产卵繁殖，孵化后的幼鱼再返海肥育。约每年的2月中旬开始，亲鱼由海入江进行生殖洄游[16]。长江刀鲚资源调查协作组的调查指出，长江刀鲚的渔获量自1973年达最高值后开始下降[12]，且种群的年龄、体长、体重等都有趋低的现象[13]。长江刀鲚雄性生殖生物学的研究仅仅局限于生殖系统的结构和精子的超微结构等方面的研究[17]。本文中研究的HSP90就是主要取自于刀鲚的精巢，从分子层面研究刀鲚对不同环境的应激反应已经成为其生殖生物学研究的一个热点问题。
1 材料与方法
1．1 实验材料及数据来源
于2014年5 月～8 月，在长江各江段段采集刀鲚，取刀鲚鱼体肝、肠、肌肉等组织。迅速取出各个组织，用DEPC处理水配制的磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS；pH 7.4)漂洗干净，迅速装入2.0 ml EP管中，立即投入液氮中并且贮存于80℃用于基因克隆和组织表达研究。
1．2 总RNA的提取
用于RNA抽提所使用的所有塑料器皿、离心管、微量移液管等均用0.05% DEPC水浸泡在通风橱中过夜处理12h后将DEPC水小心倒入废液缸，将装有DEPC处理过的塑料制品的大烧杯用铝箔纸封口，高温高压蒸汽灭菌至少30min。将灭菌的塑料制品于70℃烘箱中烘干置洁净处备用。所有备用的玻璃器皿和研钵均在0.05% DEPC洗液中浸泡过夜后，用去离子水清洗干净并用铝箔纸包裹于180℃恒温烘箱中烘烤6 h以上待冷却后备用。所有操作均佩戴口罩和乳胶手套，以防止对抽提RNA的影响和药品对人体的危害。
目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 实验材料及数据来源 2
1.2 总RNA的提取 2
1.3 cDNA第一链的合成 3
1.4 目的片段的获得 3
1.5 PCR 产物回收纯化与克隆测序 4
1.6 基因片段序列分析 4
1.7 基因表达谱分析 4
1.7.1 RTPCR 4
1.7.2 qRTPCR分析 4
1.8 数据统计分析 5
2 结果与分析 5
2.1 HSP90 cDNA的特性 5
2.2 HSP90的表达模式分析 7
2.3 HSP90表达模式与刀鲚精巢发育的关系 8
3 结论 8
4 讨论 8
致谢 9
参考文献： 9
长江刀鲚热休克蛋白HSP90基因的克隆与表达分析
引言
热休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)是从原核生物到真核生物普遍存在的一种高度保守的蛋白质。在提高细胞对应激的耐受性及维护细胞自稳等方面具有重要的生物学功能［13]，对维持机体的稳定也发挥着重要作用，目前已成为当今世界生命科学研究领域的热点。最早关于HSP的研究是Ritossa[4]于1962年在试验中发现,将果蝇幼虫的饲养温度由25℃提高至30℃,30 min后,其唾液腺染色体上出现了特殊的“膨 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
突”。Tissieres[5]于1974年证实发生这种现象的原因是因为这个过程中产生了一系列分子量为70 kDa和26 kDa的蛋白质,这些蛋白质被命名为热休克蛋白质。依其分子量的大小及同源程度分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量热休克蛋白[3]。HSP90是HSPs家族中重要成员之一,除具有稳定蛋白质结构、参与细胞周期调控的作用,还在各种疾病的治疗中发挥重要作用,如应激损伤、肿瘤、自身免疫性等疾病[69]，适量HSP90的存在对维持动物正常生长发育是必需的[10]。在细胞发生应激反应时，HSP90可与因环境刺激而使自身构象发生改变的蛋白相互作用，保证蛋白进行适当的折叠并防止蛋白非特异性聚集，增强动物对环境刺激的适应能力。
HSP90是一个无处不在的，高度保守的蛋白质，即使在非胁迫条件下也占细胞总蛋白的2%。它有大量折叠活动的各种受体蛋白。HSP90相互作用蛋白的种类已经增长到近300种蛋白质，并且这些蛋白质的种类数量会继续增长。HSP90是由各种活性的相互作用调制的活动，它可以作为ATP酶活性的调节，影响受体的选择，为目标受体的蛋白质降解，招募其他的分子伴侣，或影响的细胞定位[1821]。在人类和小鼠中，有两种胞质HSP90亚型，由两个独立的基因编码。他们有85.8%的同源性和93.4%的相似性，该两种异构体高度同源[11]。
HSP90在细胞正常代谢过程中负责蛋白的折叠、组装、转运和降解；当机体受到环境胁迫或有害刺激时，会诱导热休克蛋白的表达，稳定蛋白和膜结构，并协助蛋白再折叠，最终维持细胞稳态。大量研究已证明热休克蛋白普遍作用于生物热应激反应，发生作用的基因与诱导条件因物种不同而存在差异。早期研究大多数建立在蛋白质电泳与放射自显影技术基础上，检测到的热休克蛋白按照分子量大小分属于不同基因家族；近年来，研究热点主要集中在特定应激条件下相关热休克蛋白的表达与编码基因的作用机理研究等方面。热休克蛋白90是HSP家族中重要成员之一，除具有稳定蛋白质结构、参与细胞周期调控的作用，还在应激损伤、肿瘤、自身免疫性等疾病治疗中发挥重要作用。
刀鲚，又称长颌鲚，俗称刀鱼，隶属鲱形目，鲱科，鲚属。我国长江中下游地区分布的的刀鲚最早是Jorden和Seale于1905年根据上海标本命名的一个物种。刀鲚是一种溯河洄游性鱼类，平时生活在中国、日本和朝鲜沿海，春季性成熟后从河口溯江而上进入江、湖中产卵繁殖，孵化后的幼鱼再返海肥育。约每年的2月中旬开始，亲鱼由海入江进行生殖洄游[16]。长江刀鲚资源调查协作组的调查指出，长江刀鲚的渔获量自1973年达最高值后开始下降[12]，且种群的年龄、体长、体重等都有趋低的现象[13]。长江刀鲚雄性生殖生物学的研究仅仅局限于生殖系统的结构和精子的超微结构等方面的研究[17]。本文中研究的HSP90就是主要取自于刀鲚的精巢，从分子层面研究刀鲚对不同环境的应激反应已经成为其生殖生物学研究的一个热点问题。
1 材料与方法
1．1 实验材料及数据来源
于2014年5 月～8 月，在长江各江段段采集刀鲚，取刀鲚鱼体肝、肠、肌肉等组织。迅速取出各个组织，用DEPC处理水配制的磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS；pH 7.4)漂洗干净，迅速装入2.0 ml EP管中，立即投入液氮中并且贮存于80℃用于基因克隆和组织表达研究。
1．2 总RNA的提取
用于RNA抽提所使用的所有塑料器皿、离心管、微量移液管等均用0.05% DEPC水浸泡在通风橱中过夜处理12h后将DEPC水小心倒入废液缸，将装有DEPC处理过的塑料制品的大烧杯用铝箔纸封口，高温高压蒸汽灭菌至少30min。将灭菌的塑料制品于70℃烘箱中烘干置洁净处备用。所有备用的玻璃器皿和研钵均在0.05% DEPC洗液中浸泡过夜后，用去离子水清洗干净并用铝箔纸包裹于180℃恒温烘箱中烘烤6 h以上待冷却后备用。所有操作均佩戴口罩和乳胶手套，以防止对抽提RNA的影响和药品对人体的危害。
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