甲基睾酮对雄性罗非鱼能量代谢相关基因表达影响的研究
雄激素化合物可以对鱼类的能量代谢产生影响，在本研究中，吉富尼罗罗非鱼分别被暴露在甲基睾酮（MT，0.5和5 mg/L）中7天、14天和21天，通过测量鱼的鳃、肾和肠中的Na+-K+ ATP酶(NKA)、Ca+-Mg+ ATP酶(CMA)的活性来评估吉富罗非鱼渗透调节的变化，同时也能检测基因毒性。结果显示在5 mg/L甲基睾酮暴露组中有机体的NKA显著降低，肠中的NKA显著增加(0.5 mg/L MT)，甲基睾酮(0.5 mg/L)使肾和肠中的CMA增加，相同情况出现在5 mg/L MT组的鳃中的CMA。基因毒性试验结果表明，鳃atp1a1a和NKCC2转录显著增加，同时肠的atp1a1a和fxyd7的转录也显示显著增加。这项研究提出的证据表明甲基睾酮的慢性暴露会使吉富罗非鱼能量代谢相关基因表达发生改变。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1前期准备 2
1.2样品采集与处理2
1.3数据测定与方法3
1.3.1引物设计与合成3
1.3.2总RNA提取3
1.3.3反转录3
1.3.4 qRTPCR扩增4
2结果与分析4
3讨论5
致谢6
参考文献6
甲基睾酮对雄性罗非鱼能量代谢相关基因表达影响的研究
引言
甲基睾酮（MT），别名甲基睾丸酮，白色或乳白色结晶性粉末，是由瑞士原Ciba公司研发的留体类雄性激素药物，具有雄性和蛋白同化双重作用[1]。在水生领域研究中经常被用来诱导雄性性器官发育成熟和第二性征的形成[2]，例如，雄性罗非鱼和黄鲶鱼的生长速度比雌性快，并且甲基睾酮浸泡的性未成熟的孵化的幼虫已被用来生产全雄群体[3]。用于鱼类养殖的甲基睾酮的正常剂量为60mg/L，目前，我国北京地区的废水中已经检测到残留的甲基睾酮[3]，我们知道甲基睾酮有可能诱导氧化应激，我们以前的研究表明，在甲基睾酮暴露下，罗非鱼肝脏抗氧化酶活性会增加，我们的研究结果首先表明甲基睾酮应激反应，如某些抗氧化酶基因表达的增加；氧化产物与抗氧化酶的损耗 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
。然而，抗氧化反应在高浓度甲基睾酮(5 mg/L)和低浓度甲基睾酮(0.5 mg/L)对照组中是不同的，我们的另一项研究表明在灭多威[11]暴露下，罗非鱼的肝脏抗氧化活性是不可逆的。这意味着更高的测试毒物浓度或者更长期的暴露会损害组织。
吉富罗非鱼，它有很强的适应能力，在海水、淡水中均可生存[3]。对污染物的氧化应激反应敏感，可作为一种理想的毒性实验材料。吉富罗非鱼，一个热带物种，适宜生存于温暖水域，对水环境因子十分敏感。在遇到水渗透压变化时，水生生物具有发达的渗透压调节装置来调节流体和离子运输，离子渗透对于维持组织和细胞的功能是至关重要的，鱼的鳃是公认的可以适应外部渗透压较大变化的高效离子渗透调节装置。
活性氧主要在线粒体中产生，而Na+K+ ATP酶(NKA)、Ca+Mg+ ATP酶(CMA)与离子转运相关[14]，渗透调节的主要靶器官是鳃、肾和小肠[15]。NKA的下降与线粒体电子传递链活性降低的联合作用有关[16]。罗非鱼的肾的NKA在镉暴露下增加。鳃NKA可作为一个敏感的生物标志物来评估罗非鱼种群的健康状况。同时罗非鱼鳃组织的NKA和CMA在污染水体中可作为一种敏感的生物标志物[4]。罗非鱼在各种应激下离子泵的基因转录水平显示出明显提高。两种Na+K+ ATP酶α1亚型(α1a 和 α1b)主要在鳃表达，并且α1a主要在淡水罗非鱼中表达[5]。与盐运输过程相关的关键蛋白被认为是钠/钾/氯协同转运蛋白1（NKCC2）[17]。
有些环境激素可作用于人和动物的遗传物质，使其结构发生变化，从而使携带遗传信息的基因发生改变，由于雄激素能促进雄性的性器官和第二性征的发育与维持，以及促进蛋白质合成，使身体肌肉更发达，一些人工合成雄激素被广泛应用于医疗，畜禽和水产养殖[9]。在水产养殖业中，MT—直作为苗种培育和性别控制等方面的特效药物[10]。通过有关甲基睾酮对雄性罗非鱼能量代谢相关基因表达影响的研究，可以为甲基睾酮在水产养殖业中的使用及罗非鱼的饲养等提供理论指导。
1 材料与方法
1．1前期准备
吉富罗非鱼的受精卵由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，宜兴基地提供。一个月大的罗非鱼幼鱼用于实验，并在28 ± 1 °C的脱氯自来水的水族馆设施中进行培养，周期为14小时/10小时的光/暗周期。试验鱼一天喂食两次（鱼饲料购自江苏哲雅食品，中国有限公司）。实验条件如下：
pH：7.1 ± 0.5；
溶解氧浓度（由美国YSI 556MPS测试）：7.16 ± 0.16 mg/L；
总磷酸盐浓度：2.16 ± 0.17 mg/L；
总氮和氨氮浓度（纳氏试剂分光光度法）：0.52 ± 0.15 mg/L 和 0.44 ± 0.06 mg/L；
水体总硬度（ICPOES，最优7000，珀金埃尔默，美国）[6]：
碳酸钙194.3 ± 13.0 mg/L；铅0.96 ± 0.09 μg/L；铜2.65 ± 0.14 μg/L； 锌11.78 ± 0.32 μg/L；镉0.15 ± 0.04 μg/L；化学需氧量（COD）12.45 ± 0.65 mg/L；
试验用吉富罗非鱼共90条，平均体重为69.47 ± 6.13 g，平均长度为9.25 ± 1.02 cm，共分九组，每组10条，时间按7天、14天和21天再分为三组，每组鱼暴露于0,0.5和5 mg/L MT中。在暴露实验中，体重或长度无统计学意义的差异，在实验过程中，没有观察到鱼的死亡。
1．2 样品采集与处理
在每个实验周期结束时，对试验鱼进行解剖，收集鳃、肾、肠和肝脏等组织作为基因表达和生化分析的样品。特别是对基因表达的研究样品要采用Trizol试剂进行匀浆，然后立即进行液氮冷冻并储存在80°C的环境中直到进行ATP酶分析[7]。将组织加入比率为1/10的含有20 mM Tris–HCl, 0.25 M蔗糖和1 mM EDTA (pH 7.7)的冰冷缓冲液中，在9500转的条件下进行23分钟的摇匀。将匀浆在13000g，4°C的条件下进行20分钟的离心，收集上清液以便进行ATP酶活性的测定[8]。我们采用从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒对上清中的NKA和CMA的活性测定进行分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1前期准备 2
1.2样品采集与处理2
1.3数据测定与方法3
1.3.1引物设计与合成3
1.3.2总RNA提取3
1.3.3反转录3
1.3.4 qRTPCR扩增4
2结果与分析4
3讨论5
致谢6
参考文献6
甲基睾酮对雄性罗非鱼能量代谢相关基因表达影响的研究
引言
甲基睾酮（MT），别名甲基睾丸酮，白色或乳白色结晶性粉末，是由瑞士原Ciba公司研发的留体类雄性激素药物，具有雄性和蛋白同化双重作用[1]。在水生领域研究中经常被用来诱导雄性性器官发育成熟和第二性征的形成[2]，例如，雄性罗非鱼和黄鲶鱼的生长速度比雌性快，并且甲基睾酮浸泡的性未成熟的孵化的幼虫已被用来生产全雄群体[3]。用于鱼类养殖的甲基睾酮的正常剂量为60mg/L，目前，我国北京地区的废水中已经检测到残留的甲基睾酮[3]，我们知道甲基睾酮有可能诱导氧化应激，我们以前的研究表明，在甲基睾酮暴露下，罗非鱼肝脏抗氧化酶活性会增加，我们的研究结果首先表明甲基睾酮应激反应，如某些抗氧化酶基因表达的增加；氧化产物与抗氧化酶的损耗 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
。然而，抗氧化反应在高浓度甲基睾酮(5 mg/L)和低浓度甲基睾酮(0.5 mg/L)对照组中是不同的，我们的另一项研究表明在灭多威[11]暴露下，罗非鱼的肝脏抗氧化活性是不可逆的。这意味着更高的测试毒物浓度或者更长期的暴露会损害组织。
吉富罗非鱼，它有很强的适应能力，在海水、淡水中均可生存[3]。对污染物的氧化应激反应敏感，可作为一种理想的毒性实验材料。吉富罗非鱼，一个热带物种，适宜生存于温暖水域，对水环境因子十分敏感。在遇到水渗透压变化时，水生生物具有发达的渗透压调节装置来调节流体和离子运输，离子渗透对于维持组织和细胞的功能是至关重要的，鱼的鳃是公认的可以适应外部渗透压较大变化的高效离子渗透调节装置。
活性氧主要在线粒体中产生，而Na+K+ ATP酶(NKA)、Ca+Mg+ ATP酶(CMA)与离子转运相关[14]，渗透调节的主要靶器官是鳃、肾和小肠[15]。NKA的下降与线粒体电子传递链活性降低的联合作用有关[16]。罗非鱼的肾的NKA在镉暴露下增加。鳃NKA可作为一个敏感的生物标志物来评估罗非鱼种群的健康状况。同时罗非鱼鳃组织的NKA和CMA在污染水体中可作为一种敏感的生物标志物[4]。罗非鱼在各种应激下离子泵的基因转录水平显示出明显提高。两种Na+K+ ATP酶α1亚型(α1a 和 α1b)主要在鳃表达，并且α1a主要在淡水罗非鱼中表达[5]。与盐运输过程相关的关键蛋白被认为是钠/钾/氯协同转运蛋白1（NKCC2）[17]。
有些环境激素可作用于人和动物的遗传物质，使其结构发生变化，从而使携带遗传信息的基因发生改变，由于雄激素能促进雄性的性器官和第二性征的发育与维持，以及促进蛋白质合成，使身体肌肉更发达，一些人工合成雄激素被广泛应用于医疗，畜禽和水产养殖[9]。在水产养殖业中，MT—直作为苗种培育和性别控制等方面的特效药物[10]。通过有关甲基睾酮对雄性罗非鱼能量代谢相关基因表达影响的研究，可以为甲基睾酮在水产养殖业中的使用及罗非鱼的饲养等提供理论指导。
1 材料与方法
1．1前期准备
吉富罗非鱼的受精卵由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，宜兴基地提供。一个月大的罗非鱼幼鱼用于实验，并在28 ± 1 °C的脱氯自来水的水族馆设施中进行培养，周期为14小时/10小时的光/暗周期。试验鱼一天喂食两次（鱼饲料购自江苏哲雅食品，中国有限公司）。实验条件如下：
pH：7.1 ± 0.5；
溶解氧浓度（由美国YSI 556MPS测试）：7.16 ± 0.16 mg/L；
总磷酸盐浓度：2.16 ± 0.17 mg/L；
总氮和氨氮浓度（纳氏试剂分光光度法）：0.52 ± 0.15 mg/L 和 0.44 ± 0.06 mg/L；
水体总硬度（ICPOES，最优7000，珀金埃尔默，美国）[6]：
碳酸钙194.3 ± 13.0 mg/L；铅0.96 ± 0.09 μg/L；铜2.65 ± 0.14 μg/L； 锌11.78 ± 0.32 μg/L；镉0.15 ± 0.04 μg/L；化学需氧量（COD）12.45 ± 0.65 mg/L；
试验用吉富罗非鱼共90条，平均体重为69.47 ± 6.13 g，平均长度为9.25 ± 1.02 cm，共分九组，每组10条，时间按7天、14天和21天再分为三组，每组鱼暴露于0,0.5和5 mg/L MT中。在暴露实验中，体重或长度无统计学意义的差异，在实验过程中，没有观察到鱼的死亡。
1．2 样品采集与处理
在每个实验周期结束时，对试验鱼进行解剖，收集鳃、肾、肠和肝脏等组织作为基因表达和生化分析的样品。特别是对基因表达的研究样品要采用Trizol试剂进行匀浆，然后立即进行液氮冷冻并储存在80°C的环境中直到进行ATP酶分析[7]。将组织加入比率为1/10的含有20 mM Tris–HCl, 0.25 M蔗糖和1 mM EDTA (pH 7.7)的冰冷缓冲液中，在9500转的条件下进行23分钟的摇匀。将匀浆在13000g，4°C的条件下进行20分钟的离心，收集上清液以便进行ATP酶活性的测定[8]。我们采用从南京建成生物工程研究所购买的试剂盒对上清中的NKA和CMA的活性测定进行分析。
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