黄鳝性别相关基因dmrt在不同组织下甲基化分析
DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一，在基因表达调控中发挥重要作用本研究以生长在不同光照，温度，PH环境因素的黄鳝为研究对象。目的是为分析不同光照，温度，PH对黄鳝DMRT基因在不同组织中的甲基化程度差异。实验采用甲基化敏感的限制性内切酶方法方法，筛选出4对引物进行扩增，用1%的琼脂糖检测，结果: 不同生态因子条件下，在五个组织的扩增序列中，DMRT2-FR2位点均是甲基化；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3均是去甲基化。说明这四个位点的甲基化状态非常稳定，环境因子的小幅变化对其影响不大。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1试验材料 3
1.1试验试剂 3
1.2主要仪器 3
2 试验方法 3
2.1 DNA的提取 3
2.2 DMRT的酶切 4
2.3 DMRT基因酶切产物的扩增 4
3实验结果 5
3.1Dmrt3FR2酶切结果 5
3.2Dmrt4FR2酶切温度28℃条件下的结果 5
3.3 Dmrt4FR2酶切光照10h条件下结果 5
3.4黄鳝DMRT基因的甲基化分析 6
4.分析与讨论 6
致谢 9
参考文献： 9
黄鳝性别相关基因DMRT在不同组织的甲基化分析
引言
黄鳝（Monopterus albus）俗称鳝鱼、田鳗、蛇鱼、长鱼，属硬骨鱼纲（Osteichthyes）,辐鳍亚纲（Actinopterygii）,合鳃目（Synbranchiformes）,合鳃科（Symbranchidae）,黄鳝属（Monopterus），为淡水底栖定居性鱼类[1]。黄鳝因肉质细嫩、鲜美可口、营养价值高"具有一定的滋补和药用功能" 因此成为深受我国消费者青睐的水产品。然而黄鳝苗种的获取，限制于只有通过天然繁殖才能大量获取，人工繁殖十分困难。随着野生环境的破坏，捕捞强度提升但捕捞数量的下降，导致黄鳝苗价格上扬却仍然有价无市。成功地解决黄鳝的人工繁殖技术将成为发展 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
其规模养殖的先决条件。但因黄鳝独特的性逆转现象使得在黄鳝繁殖群体中,雌性个体小,怀卵量少,繁殖力很低,极大地限制了黄鳝人工繁殖规模和水平[2]。因此，开展黄鳝性逆转机制的探究，有利于解决黄鳝人工繁殖难题。又因鱼类在脊椎动物系统进化中处于承前启后的关键地位。鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性,并具有所有脊椎动物的性别决定方式,存在从雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型,性逆转在鱼类也是较为常见的现象[3]。而黄鳝这种在个体发育中存在天然性反转现象,是研究鱼类性别决定和分化的好材料[4]。研究这种具有典型性逆转的水生生物对整个脊柱动物性别决定机制的形成及进化途径的揭示。
自1944年发现黄鳝性逆转的特性以来,为了揭示黄鳝性逆转的发生机制,很多学者分别从生理生化、细胞学和分子生物学等发面做了很多努力[5]。因分子生物学技术的迅猛发展, 鱼类性别相关基因及性别决定机理的研究已经取得了初步的进展。已经由最初的研究鱼类基因组中的哺乳动物性别决定基因，逐渐转化为在鱼类自身寻找性别决定基因。但围绕着黄鳝有关基因:CYP19、vasa、sry、sox、JNK1、dmrt1等的研究, 国内外学者均未取得突破性进展,黄鳝性别调控机制依然处于较模糊状态。同时通过近年来的研究，还发现鱼类性别调控不仅与基因有关。很多外部环境因素也能不同程度地影响其性别分化,从而使鱼类性别决定机制变得极其复杂。根据现有的报道,在各种外部环境因素中,温度、pH值、盐度、光照、水质、食物丰度和种群内部因素等都可能影响鱼类性别及其分化[6]。宏观的环境因素作用在生物上导致其微观分子基因的活动，而使生物生理生活习性的改变。对于阐明这种生命现象的核心和本质,并系统整合生物学的全部知识,对建立起真正的统一的普通生物学是很有必要的。本次实验在前人的实验结果研究酸碱度、光照、温度环境因素在分子水上对黄鳝的性别相关基因Dmrt3的影响。旨在为系统研究该基因在鱼类中的作用提供参考。
Dmrt具有进化保守性,也是参与性别决定最古老的发育基因家族。其家族成员的主要特征是所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的保守基序——DM(Doublesex和Mab3)结构域。可以锌指方式与特异DNA序列结合,在性别决定和分化发育中起调控作用[7]。其中Dmrt1决定着雄性生殖细胞发生有丝分裂或减数分裂并参与了雄性的性别决定过程,该基因的缺失会导致发生性反转现象[8,9,10]。而Dmrt3 基因定位于 Dmrt1基因的 3′端，可能参与了 Dmrt1 基因的性别调控作用[11,12]。
甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因组功能的重要手段[13]。许多受甲基化变化诱导的基因同胁迫反应有关,说明DNA甲基化参与了环境胁迫下的基因表达调控过程[14]。其主要的调控对象是DNA转录。其调控手段有两种：一是由于胞嘧啶甲基化改变了 DNA分子的空间结构,直接干扰了特异转录因子与各自启动子的识别位置的结合。二是序列特异的甲基化 DNA 结合蛋白与甲基化的启动子序列特异性结合从而抑制转录因子与靶序列的结合。通过这些方式DNA甲基化可引起基因表达的抑制[15]。
正是越来越认识到对DNA甲基化研究的重要性，人们由此开发出一系列针对甲基化的检测方法。根据研究目的的不同将这些方法分为3类：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找[16]。而根据研究所用处理方法不同可以分为:基于PCR的甲基化分析方法;基于限制性内切酶的甲基化分析方法;基于重亚硫酸盐(bisulfite)的甲基化分析方法和柱层法等[17]。其中甲基化敏感的限制性内切酶方法具有操作简单，成本低廉，甲基化位点明确，实验结果易解释等优点。但也有非CCGG序列中的CG甲基化会被忽略，造成结果的误差这样的缺陷。本次实验结合前人试验结果采用甲基化敏感的限制性内切酶方法检测不同组织中DMRT3基因在3种环境因数影响下甲基化率。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1试验材料 3
1.1试验试剂 3
1.2主要仪器 3
2 试验方法 3
2.1 DNA的提取 3
2.2 DMRT的酶切 4
2.3 DMRT基因酶切产物的扩增 4
3实验结果 5
3.1Dmrt3FR2酶切结果 5
3.2Dmrt4FR2酶切温度28℃条件下的结果 5
3.3 Dmrt4FR2酶切光照10h条件下结果 5
3.4黄鳝DMRT基因的甲基化分析 6
4.分析与讨论 6
致谢 9
参考文献： 9
黄鳝性别相关基因DMRT在不同组织的甲基化分析
引言
黄鳝（Monopterus albus）俗称鳝鱼、田鳗、蛇鱼、长鱼，属硬骨鱼纲（Osteichthyes）,辐鳍亚纲（Actinopterygii）,合鳃目（Synbranchiformes）,合鳃科（Symbranchidae）,黄鳝属（Monopterus），为淡水底栖定居性鱼类[1]。黄鳝因肉质细嫩、鲜美可口、营养价值高"具有一定的滋补和药用功能" 因此成为深受我国消费者青睐的水产品。然而黄鳝苗种的获取，限制于只有通过天然繁殖才能大量获取，人工繁殖十分困难。随着野生环境的破坏，捕捞强度提升但捕捞数量的下降，导致黄鳝苗价格上扬却仍然有价无市。成功地解决黄鳝的人工繁殖技术将成为发展 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
其规模养殖的先决条件。但因黄鳝独特的性逆转现象使得在黄鳝繁殖群体中,雌性个体小,怀卵量少,繁殖力很低,极大地限制了黄鳝人工繁殖规模和水平[2]。因此，开展黄鳝性逆转机制的探究，有利于解决黄鳝人工繁殖难题。又因鱼类在脊椎动物系统进化中处于承前启后的关键地位。鱼类的性别决定机制具有原始性、多样性和易变性,并具有所有脊椎动物的性别决定方式,存在从雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型,性逆转在鱼类也是较为常见的现象[3]。而黄鳝这种在个体发育中存在天然性反转现象,是研究鱼类性别决定和分化的好材料[4]。研究这种具有典型性逆转的水生生物对整个脊柱动物性别决定机制的形成及进化途径的揭示。
自1944年发现黄鳝性逆转的特性以来,为了揭示黄鳝性逆转的发生机制,很多学者分别从生理生化、细胞学和分子生物学等发面做了很多努力[5]。因分子生物学技术的迅猛发展, 鱼类性别相关基因及性别决定机理的研究已经取得了初步的进展。已经由最初的研究鱼类基因组中的哺乳动物性别决定基因，逐渐转化为在鱼类自身寻找性别决定基因。但围绕着黄鳝有关基因:CYP19、vasa、sry、sox、JNK1、dmrt1等的研究, 国内外学者均未取得突破性进展,黄鳝性别调控机制依然处于较模糊状态。同时通过近年来的研究，还发现鱼类性别调控不仅与基因有关。很多外部环境因素也能不同程度地影响其性别分化,从而使鱼类性别决定机制变得极其复杂。根据现有的报道,在各种外部环境因素中,温度、pH值、盐度、光照、水质、食物丰度和种群内部因素等都可能影响鱼类性别及其分化[6]。宏观的环境因素作用在生物上导致其微观分子基因的活动，而使生物生理生活习性的改变。对于阐明这种生命现象的核心和本质,并系统整合生物学的全部知识,对建立起真正的统一的普通生物学是很有必要的。本次实验在前人的实验结果研究酸碱度、光照、温度环境因素在分子水上对黄鳝的性别相关基因Dmrt3的影响。旨在为系统研究该基因在鱼类中的作用提供参考。
Dmrt具有进化保守性,也是参与性别决定最古老的发育基因家族。其家族成员的主要特征是所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的保守基序——DM(Doublesex和Mab3)结构域。可以锌指方式与特异DNA序列结合,在性别决定和分化发育中起调控作用[7]。其中Dmrt1决定着雄性生殖细胞发生有丝分裂或减数分裂并参与了雄性的性别决定过程,该基因的缺失会导致发生性反转现象[8,9,10]。而Dmrt3 基因定位于 Dmrt1基因的 3′端，可能参与了 Dmrt1 基因的性别调控作用[11,12]。
甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因组功能的重要手段[13]。许多受甲基化变化诱导的基因同胁迫反应有关,说明DNA甲基化参与了环境胁迫下的基因表达调控过程[14]。其主要的调控对象是DNA转录。其调控手段有两种：一是由于胞嘧啶甲基化改变了 DNA分子的空间结构,直接干扰了特异转录因子与各自启动子的识别位置的结合。二是序列特异的甲基化 DNA 结合蛋白与甲基化的启动子序列特异性结合从而抑制转录因子与靶序列的结合。通过这些方式DNA甲基化可引起基因表达的抑制[15]。
正是越来越认识到对DNA甲基化研究的重要性，人们由此开发出一系列针对甲基化的检测方法。根据研究目的的不同将这些方法分为3类：基因组整体水平的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找[16]。而根据研究所用处理方法不同可以分为:基于PCR的甲基化分析方法;基于限制性内切酶的甲基化分析方法;基于重亚硫酸盐(bisulfite)的甲基化分析方法和柱层法等[17]。其中甲基化敏感的限制性内切酶方法具有操作简单，成本低廉，甲基化位点明确，实验结果易解释等优点。但也有非CCGG序列中的CG甲基化会被忽略，造成结果的误差这样的缺陷。本次实验结合前人试验结果采用甲基化敏感的限制性内切酶方法检测不同组织中DMRT3基因在3种环境因数影响下甲基化率。
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