长江刀鲚安庆江段腹腔内寄生虫的初步研究(附件)
本实验在长江安庆段采集刀鲚洄游群体样本作为实验材料，提取寄生于刀鲚腹腔的异尖属寄生虫，研究刀鲚体内寄生的异尖属线虫的形态特征及数量特征并通过显微镜观察其形态特征。同时，通过提取寄生虫DNA，用指定序列的引物对DNA进行PCR扩增，然后对DNA进行测序，最后确定本实验采集的异尖属寄生虫为派氏异尖线虫（Anisakis pegreffii）。结果表明，从115尾刀鲚样本中共提取出异尖属线虫191条，平均全长为15mm，平均体重为2.2mg。异尖属线虫寄生数量与刀鲚渔获规格之间的相关关系不显著。测序结果表明送检的16条异尖属线虫样本共双向测通11条，与派式异尖线虫Cytb基因的同源性为99%，基因覆盖率为100%。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.2 刀鲚寄生虫的提取与处理2
1.3生物学指标测定2
1.4 寄生虫形态观察2
1.5异尖属寄生虫分子鉴定2
2结果与分析3
2.1刀鲚样本生物学特征3
2.2简单异尖线虫样本形态描述及其生物学特征 3
2.3简单异尖线虫的分子鉴定4
2.4派式异尖线虫寄生与刀鲚渔获规格的关系4
2.5派式异尖线虫寄生与刀鲚性别的关系6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
长江刀鲚安庆江段腹腔内寄生虫的初步研究
引言
刀鲚（Coilia nasus）隶属于鲱形目、鳀科、鲚属，俗称刀鱼、毛刀鱼、毛花鱼、胡子鱼、鲚鱼等[17]，主要分布于北太平洋西部，在我国渤海、黄海和东海均有出产[8]。在生殖季节刀鲚通常集成大群，向黄河、长江和钱塘江等入海河口区域洄游[6]，其中长江刀鲚的汛期捕捞量最大，捕捞效益也最高。近年来，由于环境恶化、捕捞过度等种种原因，种群数量不断减少。
异尖属线虫[910]是寄生与刀鲚体内的主要集中寄生虫之一，其主要寄生于刀鲚[1113]的体腔里消化道周围，呈线状，两端较尖，属海洋性的种类，体形比较大，肉眼容易 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
观察到。刀鲚自海洋进入长江后，环境发生了很大变化，咸水变成了淡水，寄生在鳃耙上的中国上棒腭虱，直接受到了影响，不适应它的生活，即逐渐从鳃上脱落。而异尖属线虫寄生在体腔里，受外界环境变化影响较小，不容易脱落或死亡。所以长江流域里各个江段，都可以用它做洄游标志。当刀鲚进入长江以后，鱼体生理上要发生一系列变化，对它的生活有直接影响，一般鱼群到达产卵场之后，寄生虫数量和寄生率都变少了。因此，根据异尖属线虫[1415]在体腔中的多少和出现的百分率，还可以辅助推测刀鲚洄游群体进入产卵场前后情况。
因此，通过研究刀鲚体内寄生的异尖属线虫的形态特征，辨识其确切的物种，研究其生态学特征及数量特征,可以为刀鲚洄游生态学研究积累基础素材。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验样本为在安庆江段采集115尾刀鲚；实验材料包括游标卡尺，电子天平，镊子，剪刀，2.5%戊二醛，无水乙醇等。
1.2 刀鲚寄生虫的提取与处理
使用剪刀和镊子采集刀鲚体腔内寄生的异尖属线虫，将其放入写好编号的瓶子中，使用无水乙醇浸泡保存待测。
1.3 生物学指标测定
使用游标卡尺和电子天平分别测定刀鲚样本及寄生虫样本的生物学指标。
1.4 寄生虫形态观察
用Leica 205C解剖镜对寄生虫的基本形态进行观察。
1.5 异尖属寄生虫分子鉴定
1.5.1 DNA的提取
将寄生虫样本放入1.5ml Eppendorf 管中剪碎，采用OMEGA公司的E.Z.N.A.TMSE Blood DNA Kit试剂盒法提取寄生虫基因组DNA，具体步骤为：
1)在挑选好的备提取DNA的组织样中加入460μL?STE，20μL 10mg/ml?PK，20μL?SDS?10%，65°完全消化1.5小时后，加入30μL无水乙醇，振荡混匀，12000转离心2分钟，将上清液至吸附柱；
2)将柱子放入2ml收集管，所得液体转入柱子，12000转离心1分钟，弃滤液；
3)加入500μL?Buffer?HB，同上离心，弃滤液；
4)加入?500μL Washing，同上离心，弃滤液，重复一次；
5)12000转2分钟，甩干柱子；
6)将柱子放入新的1.5ml Eppendorf管，加入50μL 56°预热的Elution Buffer，室温静置5分钟，12000转1分钟离心洗脱DNA，重复一次，收集好提取的DNA样品。用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度。
1.5.2 刀鲚寄生虫DNA序列的扩增
扩增引物由上海铂尚生物有限公司合成，引物设计按照林氏异钩铗虫序列引物的片段进行设计：
CD1:5’GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT3’；
CD2:5’TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT3’。
PCR 反应体系为 50μL，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 20μL， 正反向引物各 lμL (0。2M/L)， DNA 模板2 μL (50 ng/μL)， ddH2O补足至50μL。用Gene Company Limited的Veriti PCR仪扩增，反应共设35个循环，循环前95℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸7min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以标准100 bp DNA Ladder(TAKARA)估算产物大小。后送上海铂尚生物有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
2 结果与分析
2.1 刀鲚样本生物学特征
本实验采取安庆江段捕捞的刀鲚115条，其中全长平均值为242mm，体长平均值为226mm，体重平均值为32mg，由所测数据做相关分析，刀鲚全长体重之间存在正相关关系，关系式为y=0.626x118.72,R2=0.8509，如图1：
图1刀鲚全长与体重的关系
2.2 异尖属线虫形态描述及其生物学特征
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1实验材料2
1.2 刀鲚寄生虫的提取与处理2
1.3生物学指标测定2
1.4 寄生虫形态观察2
1.5异尖属寄生虫分子鉴定2
2结果与分析3
2.1刀鲚样本生物学特征3
2.2简单异尖线虫样本形态描述及其生物学特征 3
2.3简单异尖线虫的分子鉴定4
2.4派式异尖线虫寄生与刀鲚渔获规格的关系4
2.5派式异尖线虫寄生与刀鲚性别的关系6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
长江刀鲚安庆江段腹腔内寄生虫的初步研究
引言
刀鲚（Coilia nasus）隶属于鲱形目、鳀科、鲚属，俗称刀鱼、毛刀鱼、毛花鱼、胡子鱼、鲚鱼等[17]，主要分布于北太平洋西部，在我国渤海、黄海和东海均有出产[8]。在生殖季节刀鲚通常集成大群，向黄河、长江和钱塘江等入海河口区域洄游[6]，其中长江刀鲚的汛期捕捞量最大，捕捞效益也最高。近年来，由于环境恶化、捕捞过度等种种原因，种群数量不断减少。
异尖属线虫[910]是寄生与刀鲚体内的主要集中寄生虫之一，其主要寄生于刀鲚[1113]的体腔里消化道周围，呈线状，两端较尖，属海洋性的种类，体形比较大，肉眼容易 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
观察到。刀鲚自海洋进入长江后，环境发生了很大变化，咸水变成了淡水，寄生在鳃耙上的中国上棒腭虱，直接受到了影响，不适应它的生活，即逐渐从鳃上脱落。而异尖属线虫寄生在体腔里，受外界环境变化影响较小，不容易脱落或死亡。所以长江流域里各个江段，都可以用它做洄游标志。当刀鲚进入长江以后，鱼体生理上要发生一系列变化，对它的生活有直接影响，一般鱼群到达产卵场之后，寄生虫数量和寄生率都变少了。因此，根据异尖属线虫[1415]在体腔中的多少和出现的百分率，还可以辅助推测刀鲚洄游群体进入产卵场前后情况。
因此，通过研究刀鲚体内寄生的异尖属线虫的形态特征，辨识其确切的物种，研究其生态学特征及数量特征,可以为刀鲚洄游生态学研究积累基础素材。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验样本为在安庆江段采集115尾刀鲚；实验材料包括游标卡尺，电子天平，镊子，剪刀，2.5%戊二醛，无水乙醇等。
1.2 刀鲚寄生虫的提取与处理
使用剪刀和镊子采集刀鲚体腔内寄生的异尖属线虫，将其放入写好编号的瓶子中，使用无水乙醇浸泡保存待测。
1.3 生物学指标测定
使用游标卡尺和电子天平分别测定刀鲚样本及寄生虫样本的生物学指标。
1.4 寄生虫形态观察
用Leica 205C解剖镜对寄生虫的基本形态进行观察。
1.5 异尖属寄生虫分子鉴定
1.5.1 DNA的提取
将寄生虫样本放入1.5ml Eppendorf 管中剪碎，采用OMEGA公司的E.Z.N.A.TMSE Blood DNA Kit试剂盒法提取寄生虫基因组DNA，具体步骤为：
1)在挑选好的备提取DNA的组织样中加入460μL?STE，20μL 10mg/ml?PK，20μL?SDS?10%，65°完全消化1.5小时后，加入30μL无水乙醇，振荡混匀，12000转离心2分钟，将上清液至吸附柱；
2)将柱子放入2ml收集管，所得液体转入柱子，12000转离心1分钟，弃滤液；
3)加入500μL?Buffer?HB，同上离心，弃滤液；
4)加入?500μL Washing，同上离心，弃滤液，重复一次；
5)12000转2分钟，甩干柱子；
6)将柱子放入新的1.5ml Eppendorf管，加入50μL 56°预热的Elution Buffer，室温静置5分钟，12000转1分钟离心洗脱DNA，重复一次，收集好提取的DNA样品。用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度。
1.5.2 刀鲚寄生虫DNA序列的扩增
扩增引物由上海铂尚生物有限公司合成，引物设计按照林氏异钩铗虫序列引物的片段进行设计：
CD1:5’GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT3’；
CD2:5’TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT3’。
PCR 反应体系为 50μL，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 20μL， 正反向引物各 lμL (0。2M/L)， DNA 模板2 μL (50 ng/μL)， ddH2O补足至50μL。用Gene Company Limited的Veriti PCR仪扩增，反应共设35个循环，循环前95℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；循环结束后于72℃延伸7min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以标准100 bp DNA Ladder(TAKARA)估算产物大小。后送上海铂尚生物有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
2 结果与分析
2.1 刀鲚样本生物学特征
本实验采取安庆江段捕捞的刀鲚115条，其中全长平均值为242mm，体长平均值为226mm，体重平均值为32mg，由所测数据做相关分析，刀鲚全长体重之间存在正相关关系，关系式为y=0.626x118.72,R2=0.8509，如图1：
图1刀鲚全长与体重的关系
2.2 异尖属线虫形态描述及其生物学特征
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