长江刀鲚体内菌群pcrdgge指纹图谱及多样性比较分析
2关键词. 2Abstract 3Key words 31.材料与方法 41.1样品采集 41.2样品处理 41.3总DNA提取 41.4 PCR-DGGE分析 41.5 DGGE图谱中部分优势条带的回收与测序分析 52.结果与分析 52.1 DGGE指纹图谱建立及分析 52.2部分优势条带的序列比对与系统发育树分析 63 讨论 8致谢 10长江刀鲚体内菌群PCR-DGGE指纹图谱及多样性比较分析 本文以长江刀鲚洄游前幼鱼和洄游后成鱼为对象，通过 PCR-DGGE 指纹技术探讨长江刀鲚菌群多样性及受洄游路径周围环境影响之后的稳定性。结果显示， PCR-DGGE 指纹谱带丰富，共显示出70条可鉴别条带，其中，长江水体谱带数(28)高于洄游后刀鲚鳃（26）、胃（26）、肠道壁（20）、肠道内容物（21）和洄游前刀鲚鳃（21）、胃（20）、肠道壁（11）、肠道内容物（13），洄游后刀鲚成鱼体内各对应部位菌群数显著高于洄游前刀鲚幼鱼。UPGMA 聚类显示不同样品之间差异显著，虽长江水体与洄游后刀鲚鳃、胃及肠道内容物样品在聚类图上聚为一簇，但其菌群结构的相似度较低，分别为43%、35%、28%。成功克隆测序其中43条条带，主要包含α-变形菌(25.6%)、β-变形菌(7%)、γ-变形菌(16.3%)、放线菌(25.6%)、厚菌门(9.3%)、拟杆菌(7%)、柔膜菌门(4.6%)、绿弯菌(2.3%)和未定义菌(2.3%)。以上结果表明长江刀鲚体内不同部位及其在洄游前后不同阶段，菌群结构存在显著差异，并受环境和宿主双层因素影响。
目录
引言
微生物个体微小，结构简单，但数量庞大，种类丰富在生命活动中扮演重要的角色, 对宿主生物体健康、营养和免疫等具有重要作用。关于鱼类微生物研究，人类早在 1953 年就有研究报道[1]，随后有关水产微生物生态生理研究报道越来越多，研究技术愈来愈成熟。不仅如此，基于16srDNA的 PCRDGGE基因指纹技术是一种不依赖分离纯化培养且菌群结构原位探究的有效方法，目前已经成为微生物群落研究强有力工具之一[2]，可以较快速揭示某一环境样品中的微生物结构组成和动态变化[3]。数据表明，该技术可鉴定出许多无法培养的菌种[4]，广泛运用于土壤[5]、海洋湖泊[6]、食品微生物[7]及动物消化道[8]等不同生态环境菌群结 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
构调查和种群动态变化分析。事实证明，不同种类的鱼，由于其食性、基因等因素，它们的肠道细菌组成和结构也不尽相同。Ward等 [9]在研究得出杂食性的 Notothenia coriiceps比肉食性的Chaenocephalus aceratus肠道微生物丰富， 也已有研究报道指出不同生长环境下鱼类的肠道细菌群落有明显的差异 [10]。尽管如此，关于洄游性鱼在不同洄游路径阶段体内菌群结构的报道较少。
刀鲚(Coilia nasus) 隶属鲱形目( Clupeiformes) 鳀科( Engraulidae) 鲚属( Coilia)，又名长颌鲚，俗称刀鲚[11]。刀鲚主要分布在中国、日本和朝鲜半岛，包括洄游、淡水定居及海水定居三种生态类型，其中洄游生态型[12]刀鲚生活史中经历两种不同的水域环境，春季性成熟后从近海口溯江产卵繁殖，秋季幼鱼沿水返海肥育。其肉质鲜美，营养丰富，与河豚、鲥鱼并称为中国长江三鲜，为名特优珍稀鱼类。本试验通过 PCRDGGE 技术检测刀鲚正态微生物区系组成，对比分析洄游前后刀鲚体内菌群进行多样性，可建立基于机体内优势菌群结构的健康评价技术，探讨长江刀鲚菌群受洄游路径周围环境影响之后的稳定性，将有助于探究刀鲚洄游路径中菌群变化特征及长江刀鲚肠道固有菌群的确定，为肠道细菌的功能提供基础依据及刀鲚养殖专用益生菌的开发奠定了基础。
1.材料与方法
1.1样品采集
本实验样品鱼采集位于长江靖江段，采集时间为：2012年9月随机抽取10尾新鲜幼鱼（洄游前刀鲚），体重为(4.94±2.57g)，体长（106.2±14.4mm）；2014年4月采集10尾长江刀鲚成鱼（洄游后刀鲚），体重为(114.51±27.91g)，体长（280.1±63.2mm），同时在刀鲚捕捞处采集水深1.5 m左右水样1 L，放置于冰上运输至实验室。
1.2样品处理
在超净工作台上处理实验鱼，先用75 %酒精喷洒体表、无菌的解剖剪刀分别取出长江刀鲚鳃、胃、肠及肠内容物，将同一批次的采集样品的相同组织合并于30℃保存备用。
水样处理在超净工作台上操作，用0.22 um 的无菌滤膜和真空抽滤装置过滤水样, 在无菌条件下将滤膜上的过滤物用无菌水在无菌培养皿中冲洗下来, 在 12000 r/min离心 5 min，收集沉淀物保存于 30℃。
1.3总DNA提取
所有样品在提取 DNA 之前需完全解冻。DNA 提取参照Yu等[13]的方法，并结合传统的CTAB法稍作修改。称取约 0.250.5 g 样品到灭菌的 2 mL 离心管，加入 1 mL 细胞裂解液[1.4 M NaCl，2% CTAB，100 nM TricHCl，50mM EDTA]，20ul 20 mg/mL蛋白酶k，20μL 20mg/mL 溶菌酶，漩涡震荡5min；37℃ 250r/min摇床振动 1h，加入100 μL 的20% SDS，漩涡混匀3 min， 65 ℃水浴40 min，13000 r/min 4℃离心 5 min，将上清吸入 2 mL 离心管中；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提，12000 r/min 离心 5min，取上清；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇重复抽提纯化一次；取上清液加入等体积氯仿∶异戊醇去酚纯化；上清液吸入至新的无菌离心管加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，20℃，放置 30min；12,000 r/min 离心10 min，弃上清；用 70%预冷乙醇洗涤沉淀，无菌风吹干，加适量无菌水溶解 DNA。样品各取5μL DNA，0.7 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.4 PCRDGGE分析
PCR具体扩增引物和条件参考文献[14]进行。将具有清晰条带 PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析。凝胶浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7 mol/L和40%（v/v）的丙烯酰胺）；变形梯度为35%55%。电泳条件：60℃，在1×TAE缓冲液中150V下电泳10小时。银染步骤参考郁二蒙等[15]的方法进行。银染后，在Vilber凝胶成像扫描系统中照像，并用BIORAD Quantity One 软件对DGGE指纹图谱进行分析，通过Biodap软件对样品泳道灰度值进行分析计算得出一些比较不同样品微生物多样性的基本指标。电泳条带的数量可以代表样品群落的丰富度指数；香农多样性指数(shannon diversity index)反应群落多样性，Evenness 代表样品群落的均匀度；BergerParker Index 用来表示优势度[16,17]。
1.5 DGGE图谱中部分优势条带的回收与测序分析
用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，加入30ul无菌水4℃静置过夜。以DNA浸出液为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系和程序参考文献[18]。将有扩增结果为200 bp左右的PCR产物进行TA克隆，并挑选阳性克隆子寄至上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，测序结果去载体并NCBI进行BLAST同源性比对分析。
2.结果与分析
目录
引言
微生物个体微小，结构简单，但数量庞大，种类丰富在生命活动中扮演重要的角色, 对宿主生物体健康、营养和免疫等具有重要作用。关于鱼类微生物研究，人类早在 1953 年就有研究报道[1]，随后有关水产微生物生态生理研究报道越来越多，研究技术愈来愈成熟。不仅如此，基于16srDNA的 PCRDGGE基因指纹技术是一种不依赖分离纯化培养且菌群结构原位探究的有效方法，目前已经成为微生物群落研究强有力工具之一[2]，可以较快速揭示某一环境样品中的微生物结构组成和动态变化[3]。数据表明，该技术可鉴定出许多无法培养的菌种[4]，广泛运用于土壤[5]、海洋湖泊[6]、食品微生物[7]及动物消化道[8]等不同生态环境菌群结 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
构调查和种群动态变化分析。事实证明，不同种类的鱼，由于其食性、基因等因素，它们的肠道细菌组成和结构也不尽相同。Ward等 [9]在研究得出杂食性的 Notothenia coriiceps比肉食性的Chaenocephalus aceratus肠道微生物丰富， 也已有研究报道指出不同生长环境下鱼类的肠道细菌群落有明显的差异 [10]。尽管如此，关于洄游性鱼在不同洄游路径阶段体内菌群结构的报道较少。
刀鲚(Coilia nasus) 隶属鲱形目( Clupeiformes) 鳀科( Engraulidae) 鲚属( Coilia)，又名长颌鲚，俗称刀鲚[11]。刀鲚主要分布在中国、日本和朝鲜半岛，包括洄游、淡水定居及海水定居三种生态类型，其中洄游生态型[12]刀鲚生活史中经历两种不同的水域环境，春季性成熟后从近海口溯江产卵繁殖，秋季幼鱼沿水返海肥育。其肉质鲜美，营养丰富，与河豚、鲥鱼并称为中国长江三鲜，为名特优珍稀鱼类。本试验通过 PCRDGGE 技术检测刀鲚正态微生物区系组成，对比分析洄游前后刀鲚体内菌群进行多样性，可建立基于机体内优势菌群结构的健康评价技术，探讨长江刀鲚菌群受洄游路径周围环境影响之后的稳定性，将有助于探究刀鲚洄游路径中菌群变化特征及长江刀鲚肠道固有菌群的确定，为肠道细菌的功能提供基础依据及刀鲚养殖专用益生菌的开发奠定了基础。
1.材料与方法
1.1样品采集
本实验样品鱼采集位于长江靖江段，采集时间为：2012年9月随机抽取10尾新鲜幼鱼（洄游前刀鲚），体重为(4.94±2.57g)，体长（106.2±14.4mm）；2014年4月采集10尾长江刀鲚成鱼（洄游后刀鲚），体重为(114.51±27.91g)，体长（280.1±63.2mm），同时在刀鲚捕捞处采集水深1.5 m左右水样1 L，放置于冰上运输至实验室。
1.2样品处理
在超净工作台上处理实验鱼，先用75 %酒精喷洒体表、无菌的解剖剪刀分别取出长江刀鲚鳃、胃、肠及肠内容物，将同一批次的采集样品的相同组织合并于30℃保存备用。
水样处理在超净工作台上操作，用0.22 um 的无菌滤膜和真空抽滤装置过滤水样, 在无菌条件下将滤膜上的过滤物用无菌水在无菌培养皿中冲洗下来, 在 12000 r/min离心 5 min，收集沉淀物保存于 30℃。
1.3总DNA提取
所有样品在提取 DNA 之前需完全解冻。DNA 提取参照Yu等[13]的方法，并结合传统的CTAB法稍作修改。称取约 0.250.5 g 样品到灭菌的 2 mL 离心管，加入 1 mL 细胞裂解液[1.4 M NaCl，2% CTAB，100 nM TricHCl，50mM EDTA]，20ul 20 mg/mL蛋白酶k，20μL 20mg/mL 溶菌酶，漩涡震荡5min；37℃ 250r/min摇床振动 1h，加入100 μL 的20% SDS，漩涡混匀3 min， 65 ℃水浴40 min，13000 r/min 4℃离心 5 min，将上清吸入 2 mL 离心管中；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提，12000 r/min 离心 5min，取上清；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇重复抽提纯化一次；取上清液加入等体积氯仿∶异戊醇去酚纯化；上清液吸入至新的无菌离心管加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，20℃，放置 30min；12,000 r/min 离心10 min，弃上清；用 70%预冷乙醇洗涤沉淀，无菌风吹干，加适量无菌水溶解 DNA。样品各取5μL DNA，0.7 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.4 PCRDGGE分析
PCR具体扩增引物和条件参考文献[14]进行。将具有清晰条带 PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析。凝胶浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7 mol/L和40%（v/v）的丙烯酰胺）；变形梯度为35%55%。电泳条件：60℃，在1×TAE缓冲液中150V下电泳10小时。银染步骤参考郁二蒙等[15]的方法进行。银染后，在Vilber凝胶成像扫描系统中照像，并用BIORAD Quantity One 软件对DGGE指纹图谱进行分析，通过Biodap软件对样品泳道灰度值进行分析计算得出一些比较不同样品微生物多样性的基本指标。电泳条带的数量可以代表样品群落的丰富度指数；香农多样性指数(shannon diversity index)反应群落多样性，Evenness 代表样品群落的均匀度；BergerParker Index 用来表示优势度[16,17]。
1.5 DGGE图谱中部分优势条带的回收与测序分析
用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，加入30ul无菌水4℃静置过夜。以DNA浸出液为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系和程序参考文献[18]。将有扩增结果为200 bp左右的PCR产物进行TA克隆，并挑选阳性克隆子寄至上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，测序结果去载体并NCBI进行BLAST同源性比对分析。
2.结果与分析
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/scyz/84.html
