超声辅助提取桦菌芝多糖的工艺优化(附件)
摘 要桦菌芝是一种疗效明确的民间用药，可用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病，在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量。多数资料表明，桦菌芝抗癌的物质基础为其多糖类成分。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，对于桦菌芝化学成分的提取、分离纯化研究以及质量标准研究的报道较少。本课题利用响应面分析法对桦菌芝多糖的提取工艺进行研究，在单因素实验基础上选取实验因素与水平，根据中心组合( Box-Benhnken) 实验设计原理采用4因素3水平的响应面分析法，依据回归分析确定各工艺条件的影响因子，以多糖提取率为响应值作响应面和等高线。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得出其最佳提取条件为：超声温度60℃，超声时间为20min，料液比1:25，超声频率80kHz。在此条件下，桦菌芝多糖的提取率可达2.35%。本课题的研究结论为桦菌芝资源的进一步开发利用提供了科学依据。 目 录
1 绪论
1.1研究背景 1
1.2 研究意义 1
1.3桦菌芝的概述 2
1.3.1生物态学特征及分布 2
1.3.2化学成分 2
1.3.3药理作用 3
1.4菌多糖的提取方法 3
1.4.1水浸提法 3
1.4.2酶提取法 4
1.4.3 超声提取技术 4
1.4.4 微波辅助浸提法 4
2实验部分
2.1试药与仪器 5
2.1.1材料与试剂 5
2.1.2仪器 5
2.2工艺流程 5
2.3桦菌芝多糖含量及提取率的测定 5
2.4实验条件的确定 5
2.4.1最大吸收波长的确定 5
2.4.2 显色条件的考察 6
2.5方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6单因素对桦菌芝多糖提取率的影响 8
2.6.1料液比对桦菌芝多糖提
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
察 6
2.5方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6单因素对桦菌芝多糖提取率的影响 8
2.6.1料液比对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.2超声时间对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.3超声温度对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.6.4超声频率对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.7桦菌芝多糖提取工艺优化 11
2.7.1响应面分析因素及水平设定 11
2.8实验性验证 16
2.9小结 17
结论 18
参考文献 19
致谢 22
1 绪论
1.1研究背景
根据WHO统计，现在全球60亿多人口中，有3710多万人患有恶性肿瘤，每年有700万患者死亡，而每年又新增加约870万新的患者。我国是世界上第一癌症大国，目前，每年发病人数在150～180万，死亡约120万人，占我国人口总死亡数的15%，预计在未来癌症的发病率越来越高，癌症已成为我国最为严重的卫生问题之一，更成为全人类所面临的共同威胁[1]。
肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。肿瘤细胞具有异常的形态、代谢和功能。它生长旺盛，常呈持续性生长。根据肿瘤对人体的危害程度可将其分成两大类：良性肿瘤和恶性肿瘤[2]。恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。肿瘤所在器官的结构和功能，侵袭破坏邻近器官，可造成器官组织坏死、出血、感染，癌组织常常因为供血不足而发生疼痛以及坏死[3]。
现行的手术治疗、化学药治疗及放疗等治疗方法在治疗肿瘤的同时所产生的毒副作用给患者的身心健康及生存质量等都造成严重的影响。然而肿瘤的治疗离不开化疗、放疗[45]。因此，研制辅助化疗，减少毒副作用的的药物越来越重要。中药多糖具有抗肿瘤作用，且没有或很少有常用抗肿瘤化疗药物的毒副作用，已越来越引起人们的重视[6]。
桦菌芝其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，有关化学成分的研究少有报道，限制了对其产品的进一步开发，不利于高附加值产品的研制。可以从化学资源的角度展开对其化学成分的系统研究，研究结果可增加人们对该真菌类化学成分的认识、化学资源的合理利用及真菌多孔菌科的化学分类均具有重要的理论意义和参考价值。
1.2 研究意义
近几年人类生存环境持续恶化，出现大量疾病，其中肿瘤疾病发病率日益增高，所以人类对药物的需求也增加[79]。药用真菌中的多糖成分具有抗肿瘤作用，然而长期的动物实验及临床试验表明使用桦菌芝无任何毒副作用，也因此受到人们越来越多的关注。宋高臣[10]等人研究桦菌芝多糖的抗肿瘤作用及其免疫学机制，结果表明桦菌芝多糖可明显抑制小鼠HepA瘤，并且能够提高荷瘤小鼠免疫器官重量、血清1L2活性及增强单核吞噬细胞功能。郭丽新[11]等人研究桦菌芝多糖对肉瘤S180的影响，结果表明桦菌芝多糖对小鼠肉瘤S180有抑制作用，可下调小鼠S180瘤组织突变型p53基因表达。对A/jia系小鼠艾式腹水癌也有显著的抑制作用。长期的临床应用表明，桦菌芝具有明显的抗癌疗效，有关资料显示，桦菌芝抗癌作用的物质基础主要为其多糖类成分[1214]。
桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，本项目旨在筛选出桦菌芝多糖的最佳提取工艺条件，以期用较低的成本得到含量较高的桦菌芝多糖，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.3桦菌芝的概述
1.3.1生物态学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚35毫米，颜色较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个；孢子长椭圆形，无色[1516]。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西（秦巴山区）、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地[17],前苏联亦产[18]。
1.3.2化学成分
桦菌芝化学成分主要包括萜类、苷类、氨基酸、氨基酸类，以及蛋白质、核苷酸有机酸、糖、脂类、色素类等。陆勇芹[19]等人对木蹄层孔菌做了简单的化学成分系统预试，在水提取液、酸性乙醇提取液、甲醇提取液和乙醚提取液中主要检测到酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、内酯、香豆素及其苷类、萜类化合物、植物甾醇及其苷类，并通过检测推断可能含有鞣质、黄酮类及其苷类。Florentyna wanda KudrzYckaBiexoszabska[20]对木蹄层孔菌的各类成分进行了定性显色检测，结果表明其子实体中含有甾醇、三萜、脂肪酸类和油脂类成分。singh,PrataP[21]等人对木蹄层孔菌子实体的石油醚提取物、氯仿提取物和乙醇提取物进行了化学检识，结果发现木蹄层孔菌的子实体中含有麦角甾醇和麦角甾烷醇。Rosecke,J.[22]等人从木蹄层孔菌子实体中分离和鉴定出麦角甾醇过氧化物，麦角备甾7烯3酮。Ahmedova,Z.P.[23]分离得到木聚糖酶、漆酶和过氧化物酶三种酶。Kapich,A.N.[24]等人在木蹄层孔菌的菌丝中检测到8种磷脂成分：磷酸卵磷酯、脑磷酯、磷脂酰甘油、丝氨酸磷脂、磷脂酰肌醇、心肌磷脂、溶血磷脂胆碱、鞘磷脂。Aoki,Michiko[25]等人从木蹄层孔菌菌丝的摇床培养液中得到抗病毒的高分子多糖。FAb.Apalovic[26]等人从木蹄层孔菌菌丝的培养液中得到联苯酚和二酚氧化酶。FavreBonvin,Jean[27]等人分离和鉴定出一种色素Anhydrofomentariol。Gripenberg,Jarl[28]等人分离和鉴定出化合物Dehydrofome
1 绪论
1.1研究背景 1
1.2 研究意义 1
1.3桦菌芝的概述 2
1.3.1生物态学特征及分布 2
1.3.2化学成分 2
1.3.3药理作用 3
1.4菌多糖的提取方法 3
1.4.1水浸提法 3
1.4.2酶提取法 4
1.4.3 超声提取技术 4
1.4.4 微波辅助浸提法 4
2实验部分
2.1试药与仪器 5
2.1.1材料与试剂 5
2.1.2仪器 5
2.2工艺流程 5
2.3桦菌芝多糖含量及提取率的测定 5
2.4实验条件的确定 5
2.4.1最大吸收波长的确定 5
2.4.2 显色条件的考察 6
2.5方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6单因素对桦菌芝多糖提取率的影响 8
2.6.1料液比对桦菌芝多糖提
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
察 6
2.5方法学考察 7
2.5.1 标准曲线的绘制 7
2.5.2 样品中多糖含量测定 7
2.5.3 仪器精密度 7
2.5.4 重现性 8
2.5.5 稳定性 8
2.5.6 加样回收率 8
2.6单因素对桦菌芝多糖提取率的影响 8
2.6.1料液比对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.2超声时间对桦菌芝多糖提取率的影响 9
2.6.3超声温度对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.6.4超声频率对桦菌芝多糖提取率的影响 10
2.7桦菌芝多糖提取工艺优化 11
2.7.1响应面分析因素及水平设定 11
2.8实验性验证 16
2.9小结 17
结论 18
参考文献 19
致谢 22
1 绪论
1.1研究背景
根据WHO统计，现在全球60亿多人口中，有3710多万人患有恶性肿瘤，每年有700万患者死亡，而每年又新增加约870万新的患者。我国是世界上第一癌症大国，目前，每年发病人数在150～180万，死亡约120万人，占我国人口总死亡数的15%，预计在未来癌症的发病率越来越高，癌症已成为我国最为严重的卫生问题之一，更成为全人类所面临的共同威胁[1]。
肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。肿瘤细胞具有异常的形态、代谢和功能。它生长旺盛，常呈持续性生长。根据肿瘤对人体的危害程度可将其分成两大类：良性肿瘤和恶性肿瘤[2]。恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。肿瘤所在器官的结构和功能，侵袭破坏邻近器官，可造成器官组织坏死、出血、感染，癌组织常常因为供血不足而发生疼痛以及坏死[3]。
现行的手术治疗、化学药治疗及放疗等治疗方法在治疗肿瘤的同时所产生的毒副作用给患者的身心健康及生存质量等都造成严重的影响。然而肿瘤的治疗离不开化疗、放疗[45]。因此，研制辅助化疗，减少毒副作用的的药物越来越重要。中药多糖具有抗肿瘤作用，且没有或很少有常用抗肿瘤化疗药物的毒副作用，已越来越引起人们的重视[6]。
桦菌芝其性平，味微苦，水煎服，治小儿积食，药用有很好的消积化癖作用。民间用于治疗胃癌、子宫癌、道癌等病。目前对桦菌芝的研究主要集中在抗癌作用及其机制方面，有关化学成分的研究少有报道，限制了对其产品的进一步开发，不利于高附加值产品的研制。可以从化学资源的角度展开对其化学成分的系统研究，研究结果可增加人们对该真菌类化学成分的认识、化学资源的合理利用及真菌多孔菌科的化学分类均具有重要的理论意义和参考价值。
1.2 研究意义
近几年人类生存环境持续恶化，出现大量疾病，其中肿瘤疾病发病率日益增高，所以人类对药物的需求也增加[79]。药用真菌中的多糖成分具有抗肿瘤作用，然而长期的动物实验及临床试验表明使用桦菌芝无任何毒副作用，也因此受到人们越来越多的关注。宋高臣[10]等人研究桦菌芝多糖的抗肿瘤作用及其免疫学机制，结果表明桦菌芝多糖可明显抑制小鼠HepA瘤，并且能够提高荷瘤小鼠免疫器官重量、血清1L2活性及增强单核吞噬细胞功能。郭丽新[11]等人研究桦菌芝多糖对肉瘤S180的影响，结果表明桦菌芝多糖对小鼠肉瘤S180有抑制作用，可下调小鼠S180瘤组织突变型p53基因表达。对A/jia系小鼠艾式腹水癌也有显著的抑制作用。长期的临床应用表明，桦菌芝具有明显的抗癌疗效，有关资料显示，桦菌芝抗癌作用的物质基础主要为其多糖类成分[1214]。
桦菌芝在陕西省乃至全国都有比较高的蕴藏量，本项目旨在筛选出桦菌芝多糖的最佳提取工艺条件，以期用较低的成本得到含量较高的桦菌芝多糖，为桦菌芝资源的开发利用特别是新制剂或新药的研发奠定基础。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发桦菌芝资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.3桦菌芝的概述
1.3.1生物态学特征及分布
桦菌芝(Phropolyporus fomentarius)，又名木蹄、木蹄层孔菌、小驴蹄子，为真菌多孔菌科褐层孔属植物木蹄的菌体。菌盖马蹄形，灰色，浅褐色至黑色，有厚角质皮壳和环状层纹，菌肉木栓质，锈色；菌管多层，层次不甚明显，每层厚35毫米，颜色较菌肉浅；管口圆形，灰色至浅褐色，每毫米34个；孢子长椭圆形，无色[1516]。多寄生于桦及栎的树干上，也生于杨、柳、赤杨、椴、榆等阔叶树的树干上。分布黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西、河南、陕西（秦巴山区）、甘肃、新疆、四川、贵州、云南、广西等地[17],前苏联亦产[18]。
1.3.2化学成分
桦菌芝化学成分主要包括萜类、苷类、氨基酸、氨基酸类，以及蛋白质、核苷酸有机酸、糖、脂类、色素类等。陆勇芹[19]等人对木蹄层孔菌做了简单的化学成分系统预试，在水提取液、酸性乙醇提取液、甲醇提取液和乙醚提取液中主要检测到酚性成分、有机酸、糖、多糖和苷类、内酯、香豆素及其苷类、萜类化合物、植物甾醇及其苷类，并通过检测推断可能含有鞣质、黄酮类及其苷类。Florentyna wanda KudrzYckaBiexoszabska[20]对木蹄层孔菌的各类成分进行了定性显色检测，结果表明其子实体中含有甾醇、三萜、脂肪酸类和油脂类成分。singh,PrataP[21]等人对木蹄层孔菌子实体的石油醚提取物、氯仿提取物和乙醇提取物进行了化学检识，结果发现木蹄层孔菌的子实体中含有麦角甾醇和麦角甾烷醇。Rosecke,J.[22]等人从木蹄层孔菌子实体中分离和鉴定出麦角甾醇过氧化物，麦角备甾7烯3酮。Ahmedova,Z.P.[23]分离得到木聚糖酶、漆酶和过氧化物酶三种酶。Kapich,A.N.[24]等人在木蹄层孔菌的菌丝中检测到8种磷脂成分：磷酸卵磷酯、脑磷酯、磷脂酰甘油、丝氨酸磷脂、磷脂酰肌醇、心肌磷脂、溶血磷脂胆碱、鞘磷脂。Aoki,Michiko[25]等人从木蹄层孔菌菌丝的摇床培养液中得到抗病毒的高分子多糖。FAb.Apalovic[26]等人从木蹄层孔菌菌丝的培养液中得到联苯酚和二酚氧化酶。FavreBonvin,Jean[27]等人分离和鉴定出一种色素Anhydrofomentariol。Gripenberg,Jarl[28]等人分离和鉴定出化合物Dehydrofome
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zygc/1028.html
