河蚬生物活性肽制备及其活性研究(附件)
河蚬的生物活性肽是一种具有抗氧化、抑菌、降胆固醇等生物活性的多肽。本实验以河蚬肉为原料，用超声波提取粗品，采用单因素及正交实验对酶解工艺优化，得到最佳工艺为：加酶量为4000U/g，pH值为8.5，酶解温度为55℃，液固比为40:1，酶解时间为4h，最终得出DPPH自由基清除率为64.7%。关键词 河蚬生物活性肽，超声波提取，单因素，正交试验，自由基清除率目 录
1 引言 1
1.1 河蚬 1
1.2 河蚬的生物价值与研究现状 1
1.3 活性肽简介 2
1.3.1 活性肽的研究现状 2
1.3.2活性肽的制备方法 3
1.3.2.1化学合成法制备活性肽 4
1.3.2.2酶法制备活性肽 4
1.3.2.3微生物发酵法制备活性肽 4
1.3.2.4活性肽制备的其他方法 5
2 实验材料与方法 5
2.1 材料 5
2.2 试剂与仪器 5
2.2.1 主要试剂及药品 5
2.2.2 主要实验仪器 6
2.3 实验方法 6
2.3.1工艺流程 6
2.3.2 酶解工艺单因素试验 7
2.3.3 酶解正交试验 7
2.3.4 DPPH自由基清除能力实验 8
3 结果与分析 8
3.1 加酶量对DPPH自由基清除率的影响 8
3.2 液固比对DPPH自由基清除率的影响 9
3.3 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响 9
3.4 酶解温度对DPPH自由基清除率的影响 10
3.5 酶解pH对DPPH自由基清除 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
率的影响 11
3.6确定最佳酶解方案 11
3. 7 正交试验结果及分析 12
3.8 验证试验 13
结论 14
致谢 15
参考文献 16
1 引言
1.1 河蚬
河蚬贝壳中等大小，呈圆底三角形，壳高与壳长近似，两壳膨胀，壳顶高，稍偏向前方。壳面有光泽，颜色因环境而异，常呈棕黄色、黄绿色或黑褐色。壳面有粗糙的环肋。韧带短，突出于壳外。绞合部发达，闭壳肌痕明显，外套痕深而显著。河蚬栖息于淡水的湖泊、沟渠、池塘及咸淡水交汇的江河中，广泛分布于我国内陆水域。在俄罗斯、日本、朝鲜、东南亚各国均有分布。其肉味鲜美，营养价值高，经济价值高，具有很好的药用效果。可供食用，也是鱼类、水禽的天然饲料，又为中药药材，也可做为农田肥料。河蚬含七种人体必需氨基酸，其中两种为人体半必需氨基酸，蛋白质含量高于牡蛎、文蛤、翡翠贻贝[1~2]。
1.2 河蚬的生物价值与研究现状
河蚬不但可以作为中药的药材，有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治肝病、麻疹退热、止咳化痰、解酒等功效，而且还是禽畜类和鱼类的天然饵料。经过粉碎的蚬肉、蚬壳配入混合饲料，饲喂禽畜有促进生长繁殖的作用，可提高禽类产蛋率、畜类产乳率。河蚬也可作为某些特种水产品的鲜活饵科，近几年来，随着鳖、鲤鱼、黄鳝、蟹养殖的发展，人们也开始重视河蚬的养殖。由于河蚬所具有的营养价值，药用价值及食疗价值，对河蚬的开发研究越来越受到国内外专家和学者的关注邱春江[3]等利用木瓜蛋白酶水解花蚬蛋白，得到的酶解物具有很强的清除羟自由基能力。刘杰[4]等研究了河蚬酶解液的体外抗氧化作用，发现酶解液具有显著的清除超氧阴离子自由基和羟自由基作用。张磊[5]等探讨了河蚬提取物可能通过抑制脂质过氧化反应对酒精性肝损伤有保护作用。韩鹏[6]等研究了河蚬乙酸乙酯提取物对DPPH自由基具有一定的清除作用。近年来利用可控酶解技术从水产品中制备抗氧化活性肽的研究时有报道，如Je[7]等采用海鱼副产物（如鳕鱼骨架蛋白、青鳕鱼皮胶原蛋白、阿拉斯加青鳕鱼骨架蛋白等）制备出具有抗氧化活性的水解产物；Suetsuna[8]、Wu[9]等分别采用沙丁油鱼、鲭鱼水解得到了鱼类抗氧化肽。
目前，河蚬资源主要以鲜销为主，或者制成蚬干、咸蚬、罐头等粗加工方面，河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥其应有的利用潜能，随着我国养殖业的迅猛发展和人工饲养技术的不断提高，河蚬产量的逐年增长也为河蚬抗氧化肽的开发与综合利用提供了丰富的原料来源。
1.3 活性肽简介
生物活性肽（ bioactiv peptides）是对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是蛋白质中 20 个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的具有多种生物活性的化合物。这些生物活性肽以非活性状态存在于蛋白质的长链中，当用适当的蛋白酶水解时，其活性被释放出来。活性肽的生理功能主要包括三方面:免疫防御功能、免疫自稳功能、免疫监视功能[10]。人体的这三大免疫功能极为重要，任何一个功能异常都会出现异常现象包括超敏反应或者引起自身免疫性疾病等以及引起肿瘤的发生或者病毒的持续感染。目前，大量的研究结果表明，生物活性肽具有多种生物学功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素作用、抑菌、降胆固醇等作用。例如在1983 年，Marayama 和Suzuki [11]就发现酪蛋白的胰蛋白酶水解产物在体外能抑制ACE活性，从牛乳球蛋白、人乳β-酪蛋白中也得到有抑制ACE 活性的肽，具有抗高血压作用。刘大川教授[12]等人采用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，制备了分子量为1000-2000的大豆肽，它的溶解度高，在任何pH下其NSI值均大于95%，其溶解浓度达30%以上时，粘度仍较低、流动性好，吸水性低于大豆分离蛋白，且具有较强的抗氧化性。以上两个例子都很好的体现了生物活性肽的广泛应用。
生物活性肽是具有显著生物学活性的由十个至数十个氨基酸组成的肽类混合物及蛋白水解产物[13]。目前，生物活性肽的研究开发主要采用微生物蛋白酶的方法，特别是国内外在植物蛋白和动物蛋白的开发中利用微生物蛋白酶的研究已有很好的基础。然而，蛋白酶的选择以及真正实现酶解蛋白和肽类产物的专一性的释放、酶解蛋白产业化连续有效的控制和酶解反应器的设计等，仍是蛋白资源利用科技攻关的方向。
1.3.1 活性肽的研究现状
在生物活性肽的研究上，虽然目前还有多数生物活性肽的研究仍处于实验阶段，在制备以及检测上还没有一套有效的方法，尚需进一步完善，但是随着研究手段和方法的不断提高，特别是随着蛋白质工程和酶工程技术的迅速发展，生物活性肽的研究，特别是免疫活性肽与抗癌活性肽的研究，必将不断深入，将有更多的具有特殊功能的生物活性肽被发现。而随着基因工程技术的发展，利用 DNA 重组等技术，将表达活性肽的基因整合到某些微生物或动物体内，通过生物体直接表达出所需肽类，可大大增加其产量、纯度；或利用细胞培养技术大批量培养重组细胞用于生产生物活性肽可以提高产量[14]。
美国化学家于1963年创建了经典的固相多肽合成法并因此获得1984年诺贝尔化学奖。该法主要是将带有氨基保护基的氨基酸的羧基端固定到不溶性树脂上，脱去该氨基酸上的氨基保护基，同下一个氨基酸的活化羧基形成酯键，从而延伸肽链形成多肽。多肽固相合成法经过不断的改进和完善，已经广泛用于多肽和蛋白质的研究领域，尤其是短肽的合成[18]。
1 引言 1
1.1 河蚬 1
1.2 河蚬的生物价值与研究现状 1
1.3 活性肽简介 2
1.3.1 活性肽的研究现状 2
1.3.2活性肽的制备方法 3
1.3.2.1化学合成法制备活性肽 4
1.3.2.2酶法制备活性肽 4
1.3.2.3微生物发酵法制备活性肽 4
1.3.2.4活性肽制备的其他方法 5
2 实验材料与方法 5
2.1 材料 5
2.2 试剂与仪器 5
2.2.1 主要试剂及药品 5
2.2.2 主要实验仪器 6
2.3 实验方法 6
2.3.1工艺流程 6
2.3.2 酶解工艺单因素试验 7
2.3.3 酶解正交试验 7
2.3.4 DPPH自由基清除能力实验 8
3 结果与分析 8
3.1 加酶量对DPPH自由基清除率的影响 8
3.2 液固比对DPPH自由基清除率的影响 9
3.3 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响 9
3.4 酶解温度对DPPH自由基清除率的影响 10
3.5 酶解pH对DPPH自由基清除 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
率的影响 11
3.6确定最佳酶解方案 11
3. 7 正交试验结果及分析 12
3.8 验证试验 13
结论 14
致谢 15
参考文献 16
1 引言
1.1 河蚬
河蚬贝壳中等大小，呈圆底三角形，壳高与壳长近似，两壳膨胀，壳顶高，稍偏向前方。壳面有光泽，颜色因环境而异，常呈棕黄色、黄绿色或黑褐色。壳面有粗糙的环肋。韧带短，突出于壳外。绞合部发达，闭壳肌痕明显，外套痕深而显著。河蚬栖息于淡水的湖泊、沟渠、池塘及咸淡水交汇的江河中，广泛分布于我国内陆水域。在俄罗斯、日本、朝鲜、东南亚各国均有分布。其肉味鲜美，营养价值高，经济价值高，具有很好的药用效果。可供食用，也是鱼类、水禽的天然饲料，又为中药药材，也可做为农田肥料。河蚬含七种人体必需氨基酸，其中两种为人体半必需氨基酸，蛋白质含量高于牡蛎、文蛤、翡翠贻贝[1~2]。
1.2 河蚬的生物价值与研究现状
河蚬不但可以作为中药的药材，有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治肝病、麻疹退热、止咳化痰、解酒等功效，而且还是禽畜类和鱼类的天然饵料。经过粉碎的蚬肉、蚬壳配入混合饲料，饲喂禽畜有促进生长繁殖的作用，可提高禽类产蛋率、畜类产乳率。河蚬也可作为某些特种水产品的鲜活饵科，近几年来，随着鳖、鲤鱼、黄鳝、蟹养殖的发展，人们也开始重视河蚬的养殖。由于河蚬所具有的营养价值，药用价值及食疗价值，对河蚬的开发研究越来越受到国内外专家和学者的关注邱春江[3]等利用木瓜蛋白酶水解花蚬蛋白，得到的酶解物具有很强的清除羟自由基能力。刘杰[4]等研究了河蚬酶解液的体外抗氧化作用，发现酶解液具有显著的清除超氧阴离子自由基和羟自由基作用。张磊[5]等探讨了河蚬提取物可能通过抑制脂质过氧化反应对酒精性肝损伤有保护作用。韩鹏[6]等研究了河蚬乙酸乙酯提取物对DPPH自由基具有一定的清除作用。近年来利用可控酶解技术从水产品中制备抗氧化活性肽的研究时有报道，如Je[7]等采用海鱼副产物（如鳕鱼骨架蛋白、青鳕鱼皮胶原蛋白、阿拉斯加青鳕鱼骨架蛋白等）制备出具有抗氧化活性的水解产物；Suetsuna[8]、Wu[9]等分别采用沙丁油鱼、鲭鱼水解得到了鱼类抗氧化肽。
目前，河蚬资源主要以鲜销为主，或者制成蚬干、咸蚬、罐头等粗加工方面，河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥其应有的利用潜能，随着我国养殖业的迅猛发展和人工饲养技术的不断提高，河蚬产量的逐年增长也为河蚬抗氧化肽的开发与综合利用提供了丰富的原料来源。
1.3 活性肽简介
生物活性肽（ bioactiv peptides）是对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是蛋白质中 20 个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的具有多种生物活性的化合物。这些生物活性肽以非活性状态存在于蛋白质的长链中，当用适当的蛋白酶水解时，其活性被释放出来。活性肽的生理功能主要包括三方面:免疫防御功能、免疫自稳功能、免疫监视功能[10]。人体的这三大免疫功能极为重要，任何一个功能异常都会出现异常现象包括超敏反应或者引起自身免疫性疾病等以及引起肿瘤的发生或者病毒的持续感染。目前，大量的研究结果表明，生物活性肽具有多种生物学功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素作用、抑菌、降胆固醇等作用。例如在1983 年，Marayama 和Suzuki [11]就发现酪蛋白的胰蛋白酶水解产物在体外能抑制ACE活性，从牛乳球蛋白、人乳β-酪蛋白中也得到有抑制ACE 活性的肽，具有抗高血压作用。刘大川教授[12]等人采用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，制备了分子量为1000-2000的大豆肽，它的溶解度高，在任何pH下其NSI值均大于95%，其溶解浓度达30%以上时，粘度仍较低、流动性好，吸水性低于大豆分离蛋白，且具有较强的抗氧化性。以上两个例子都很好的体现了生物活性肽的广泛应用。
生物活性肽是具有显著生物学活性的由十个至数十个氨基酸组成的肽类混合物及蛋白水解产物[13]。目前，生物活性肽的研究开发主要采用微生物蛋白酶的方法，特别是国内外在植物蛋白和动物蛋白的开发中利用微生物蛋白酶的研究已有很好的基础。然而，蛋白酶的选择以及真正实现酶解蛋白和肽类产物的专一性的释放、酶解蛋白产业化连续有效的控制和酶解反应器的设计等，仍是蛋白资源利用科技攻关的方向。
1.3.1 活性肽的研究现状
在生物活性肽的研究上，虽然目前还有多数生物活性肽的研究仍处于实验阶段，在制备以及检测上还没有一套有效的方法，尚需进一步完善，但是随着研究手段和方法的不断提高，特别是随着蛋白质工程和酶工程技术的迅速发展，生物活性肽的研究，特别是免疫活性肽与抗癌活性肽的研究，必将不断深入，将有更多的具有特殊功能的生物活性肽被发现。而随着基因工程技术的发展，利用 DNA 重组等技术，将表达活性肽的基因整合到某些微生物或动物体内，通过生物体直接表达出所需肽类，可大大增加其产量、纯度；或利用细胞培养技术大批量培养重组细胞用于生产生物活性肽可以提高产量[14]。
美国化学家于1963年创建了经典的固相多肽合成法并因此获得1984年诺贝尔化学奖。该法主要是将带有氨基保护基的氨基酸的羧基端固定到不溶性树脂上，脱去该氨基酸上的氨基保护基，同下一个氨基酸的活化羧基形成酯键，从而延伸肽链形成多肽。多肽固相合成法经过不断的改进和完善，已经广泛用于多肽和蛋白质的研究领域，尤其是短肽的合成[18]。
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