hplc法测定宫血停颗粒中柚皮苷的研究
本人签名 日期 本论文主要是对陕西步长高新制药有限公司所生产的宫血停颗粒中的主要成分柚皮苷进行含量测定研究，在此之前，宫血停颗粒质量标准中无含量测定项，本次通过HPLC法测定宫血停颗粒中柚皮苷的含量，将枳壳中柚皮苷的含量作为宫血停颗粒的质量控制指标。根据2015版中国药典标准及陕西步长高新制药有限公司生产宫血停颗粒修订质量标准的含量测定方法进行验证。高效液相色谱法快速、准确，重复性好，可作为宫血停颗粒中柚皮苷的含量检测，所以建立此质量标准方法简便、准确可以用于宫血停颗粒的质量控制。本方法的建立，不仅使药厂生产的宫血停颗粒的质量得到了保证，而且也对人体的健康提供了保障。
Key words:Palace blood stop particles;Hovenia dulcis; Naringin;Content 目 录
1 绪论 1
1.1 宫血停颗粒 1
1.1.1 宫血停颗粒的的制法 1
1.1.2 宫血停颗粒的药理作用 1
1.1.3 宫血停颗粒质量控制情况 1
1.2 枳壳的简述 2
1.2.1 枳壳化学成分研究 2
1.3 枳壳的药理作用 5
1.3.1 对胃肠平滑肌的影响 5
1.3.2 对心血管系统的影响 5
1.3.3 对子宫的影响 6
1.3.4 利尿作用的影响 6
1.3.5 其他作用 6
1.4 宫血停颗粒的临床应用及注意事项 7
1.4.1 宫血停颗粒的临床应用 7
1.4.2 宫血停颗粒的注意事项 7
1.5 研究的目的与内容 7
1.5.1 研究的目的 7
1.5.2 研究的内容 7
2 实验部分 9
2.1 实验仪器及材料 9
2.1.1 仪器 9
2.1.2 试药 9
2.1.3 试剂及材料 9
2.2 含量测定验证试验内容 9
2.2.1 色谱条件及系统适应性 9
2.2.2 样品制备方法 10
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2.2.3 方法学验证 10
2.2.4 三批样品含量测定结果验证 14
2.3 验证结果 15
2.4 验证结论 15
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 宫血停颗粒
1.1.1 宫血停颗粒的的制法
宫血停颗粒的复方制剂为：升麻，黄芪，党参, 龙骨（煅）,益母草, 旱莲草，蒲黄，当归，枳壳，牡蛎（煅），女贞子[1]。将以上十一种中药材粉碎，加水煮沸两次，第一次为90分钟 、60分钟，合并两次煎液，滤过，再将滤液浓缩至1.141.18（80℃）的相对密度。醇量为55%，充分的搅拌，放置12小时，取上清液贮存在其它容器中，沉淀物加40%乙醇适当搅拌均匀，放置2小时；取上清液与上述澄清液合并，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.301.34（50℃）的浸膏，取浸膏一份，加糖粉2.4倍，糊精0.8倍，混匀，制成颗粒，80℃以下干燥，分装，即得。
1.1.2 宫血停颗粒的药理作用
截止目前，宫血停颗粒已进行过300例临床实验。通过小鼠进行动物实验发现本品具有显著的缩短凝血时间的作用，对实验小鼠耳朵的肿胀有一定的抑制作用，小鼠扭体次数明显减少，显示本品具有止血、凝血、抗炎、镇痛作用。给ICR小鼠以最大浓度80%灌服本品药液，未检测出LD50做最大给药量测试，最大的剂量为331.2g原料药/kg，相当于人用量的267倍，结果表明灌胃给予小鼠无急性毒性作用。以三个剂量为23.58g/kg、47.15g/kg、94.3g(生药)/kg（相当于成人剂量的12.5倍、25倍、50倍）连续给成年老鼠灌胃三个月，不影响动物的正常生长发育，老鼠的大体情况良好，血液学检测及血液系列生化指标检查均在正常范围内，主重脏器指数正常，但与对照组比较无显著性差异。所有重要脏器组织学均无明显病理改变。停药恢复15天检查未见延迟毒性反应。经过二个月的长期毒性实验，未发现明显的毒性反应和迟发性毒性反应。
1.1.3 宫血停颗粒质量控制情况
宫血停颗粒对于治疗脾肾较虚，气虚血瘀者具有良好的效果，目前实验室主要检测水分、装差、溶化性、微生物限度及其理化性质，陕西步长高新制药有限公司对药物的安全性监管力度比较大，从宫血停颗粒的原药材、原辅料、中间产品及成品严格把控，并严格按照GMP相关操作规程检验，以保证药品的安全性，从而达到治疗疾病的目的，保证人体的健康。
1.2 枳壳的简述
枳壳是宫血停颗粒中主要的药材，枳壳为芸香科植物酸橙及其栽培变种干燥的未成熟果实。始载于《开宝本草》。苏颂曾称：“今医家以皮厚小者为枳实，完大者为枳壳，皆以翻肚倾盆口状，陈久着为胜。”李时珍谓：“枳乃木名，壳为果皮，故称枳壳。”枳壳在临床上运用广泛，其具有消胀通气，理气宽中的作用。收载于《中国药典》2015年版一部，主要产于陕西、湖北、江西、四川、湖南、福建等地，它的味苦、温、辛。归脾、胃、大肠经，具有良好的行气消积、化痰除痞的功效。枳壳的形态为常绿的小乔木，茎为三棱行，表面光滑，带有刺；枳壳的性状为半圆球形，翻口似盆状，直径一般为35厘米，外部的果实为棕褐色和有颗粒状突起，突起的上端有凹点状油室，上端的花柱基痕比较明显，底部有果柄痕，横截面中果皮显黄白色且光滑，厚413纳米，四面散有12列油室，瓤囊812瓣，少部分至15瓣左右，汁囊干缩呈棕色与棕褐色之间，内部为种子。果硬，不容易损坏，具有香、苦、酸等特点，是一种非常普遍的中药材。
枳壳对于现代研究具有非常重要的意义，枳壳所主治的疾病达20多种，既可治内科方面的疾病，也可治一部分妇科方面的疾病。内科疾病主要包括呼吸系统、消化系统、精神系统、心脑血管等各种疾病，例如腹胀、郁症、慢性胃炎、内脏下垂、胆石症、胸痹、便秘、胆囊炎等[1]；妇科疾病主要包括月经不调、更年期综合症、带下等，它也可以与其他药配伍，以此达到治愈疾病的目的。如与陈皮、香附和厚朴等混合可以起到通气的作用，与赤芍、白勺、丹参和川穹等混合可以起到化瘀活血的目的；与甘草、黄芪、白术、党参等配伍可以达到补益的作用。枳壳中有众多的成分，有抗病毒、抗溃疡、降血压活性，抗炎、抗突变防治心脑血管疾病，减少血栓的作用，在临床上使用也较广泛，因此对于枳壳的研究还是非常重要的。
1.2.1 枳壳化学成分研究
近代以来，多位研究者对枳壳进行了研究，其中，黄酮、生物碱、挥发油、香豆素等都是枳壳的主要化学成分。枳壳中的化学物质，在目前药物方面运用的是十分广泛的。
（1）柚皮苷：宫血停颗粒中的柚皮苷属于枳壳中的黄酮类物质，具有及其丰富的药理活性，根据相关研究表明，枳壳的水提液中，柚皮苷的含量最高、新橙皮苷次之、异柚皮苷最低[2]。通过紫外光谱法，对黄酮类化合物的结构进行了测定。最终发现，多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱有两部分组成，根据峰位、峰形及吸收强度的差异，故推测出黄酮类化合物的光谱吸收如表1.1所示
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1 绪论 1
1.1 宫血停颗粒 1
1.1.1 宫血停颗粒的的制法 1
1.1.2 宫血停颗粒的药理作用 1
1.1.3 宫血停颗粒质量控制情况 1
1.2 枳壳的简述 2
1.2.1 枳壳化学成分研究 2
1.3 枳壳的药理作用 5
1.3.1 对胃肠平滑肌的影响 5
1.3.2 对心血管系统的影响 5
1.3.3 对子宫的影响 6
1.3.4 利尿作用的影响 6
1.3.5 其他作用 6
1.4 宫血停颗粒的临床应用及注意事项 7
1.4.1 宫血停颗粒的临床应用 7
1.4.2 宫血停颗粒的注意事项 7
1.5 研究的目的与内容 7
1.5.1 研究的目的 7
1.5.2 研究的内容 7
2 实验部分 9
2.1 实验仪器及材料 9
2.1.1 仪器 9
2.1.2 试药 9
2.1.3 试剂及材料 9
2.2 含量测定验证试验内容 9
2.2.1 色谱条件及系统适应性 9
2.2.2 样品制备方法 10
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2.2.3 方法学验证 10
2.2.4 三批样品含量测定结果验证 14
2.3 验证结果 15
2.4 验证结论 15
结 论 16
参考文献 17
致 谢 19
1 绪论
1.1 宫血停颗粒
1.1.1 宫血停颗粒的的制法
宫血停颗粒的复方制剂为：升麻，黄芪，党参, 龙骨（煅）,益母草, 旱莲草，蒲黄，当归，枳壳，牡蛎（煅），女贞子[1]。将以上十一种中药材粉碎，加水煮沸两次，第一次为90分钟 、60分钟，合并两次煎液，滤过，再将滤液浓缩至1.141.18（80℃）的相对密度。醇量为55%，充分的搅拌，放置12小时，取上清液贮存在其它容器中，沉淀物加40%乙醇适当搅拌均匀，放置2小时；取上清液与上述澄清液合并，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.301.34（50℃）的浸膏，取浸膏一份，加糖粉2.4倍，糊精0.8倍，混匀，制成颗粒，80℃以下干燥，分装，即得。
1.1.2 宫血停颗粒的药理作用
截止目前，宫血停颗粒已进行过300例临床实验。通过小鼠进行动物实验发现本品具有显著的缩短凝血时间的作用，对实验小鼠耳朵的肿胀有一定的抑制作用，小鼠扭体次数明显减少，显示本品具有止血、凝血、抗炎、镇痛作用。给ICR小鼠以最大浓度80%灌服本品药液，未检测出LD50做最大给药量测试，最大的剂量为331.2g原料药/kg，相当于人用量的267倍，结果表明灌胃给予小鼠无急性毒性作用。以三个剂量为23.58g/kg、47.15g/kg、94.3g(生药)/kg（相当于成人剂量的12.5倍、25倍、50倍）连续给成年老鼠灌胃三个月，不影响动物的正常生长发育，老鼠的大体情况良好，血液学检测及血液系列生化指标检查均在正常范围内，主重脏器指数正常，但与对照组比较无显著性差异。所有重要脏器组织学均无明显病理改变。停药恢复15天检查未见延迟毒性反应。经过二个月的长期毒性实验，未发现明显的毒性反应和迟发性毒性反应。
1.1.3 宫血停颗粒质量控制情况
宫血停颗粒对于治疗脾肾较虚，气虚血瘀者具有良好的效果，目前实验室主要检测水分、装差、溶化性、微生物限度及其理化性质，陕西步长高新制药有限公司对药物的安全性监管力度比较大，从宫血停颗粒的原药材、原辅料、中间产品及成品严格把控，并严格按照GMP相关操作规程检验，以保证药品的安全性，从而达到治疗疾病的目的，保证人体的健康。
1.2 枳壳的简述
枳壳是宫血停颗粒中主要的药材，枳壳为芸香科植物酸橙及其栽培变种干燥的未成熟果实。始载于《开宝本草》。苏颂曾称：“今医家以皮厚小者为枳实，完大者为枳壳，皆以翻肚倾盆口状，陈久着为胜。”李时珍谓：“枳乃木名，壳为果皮，故称枳壳。”枳壳在临床上运用广泛，其具有消胀通气，理气宽中的作用。收载于《中国药典》2015年版一部，主要产于陕西、湖北、江西、四川、湖南、福建等地，它的味苦、温、辛。归脾、胃、大肠经，具有良好的行气消积、化痰除痞的功效。枳壳的形态为常绿的小乔木，茎为三棱行，表面光滑，带有刺；枳壳的性状为半圆球形，翻口似盆状，直径一般为35厘米，外部的果实为棕褐色和有颗粒状突起，突起的上端有凹点状油室，上端的花柱基痕比较明显，底部有果柄痕，横截面中果皮显黄白色且光滑，厚413纳米，四面散有12列油室，瓤囊812瓣，少部分至15瓣左右，汁囊干缩呈棕色与棕褐色之间，内部为种子。果硬，不容易损坏，具有香、苦、酸等特点，是一种非常普遍的中药材。
枳壳对于现代研究具有非常重要的意义，枳壳所主治的疾病达20多种，既可治内科方面的疾病，也可治一部分妇科方面的疾病。内科疾病主要包括呼吸系统、消化系统、精神系统、心脑血管等各种疾病，例如腹胀、郁症、慢性胃炎、内脏下垂、胆石症、胸痹、便秘、胆囊炎等[1]；妇科疾病主要包括月经不调、更年期综合症、带下等，它也可以与其他药配伍，以此达到治愈疾病的目的。如与陈皮、香附和厚朴等混合可以起到通气的作用，与赤芍、白勺、丹参和川穹等混合可以起到化瘀活血的目的；与甘草、黄芪、白术、党参等配伍可以达到补益的作用。枳壳中有众多的成分，有抗病毒、抗溃疡、降血压活性，抗炎、抗突变防治心脑血管疾病，减少血栓的作用，在临床上使用也较广泛，因此对于枳壳的研究还是非常重要的。
1.2.1 枳壳化学成分研究
近代以来，多位研究者对枳壳进行了研究，其中，黄酮、生物碱、挥发油、香豆素等都是枳壳的主要化学成分。枳壳中的化学物质，在目前药物方面运用的是十分广泛的。
（1）柚皮苷：宫血停颗粒中的柚皮苷属于枳壳中的黄酮类物质，具有及其丰富的药理活性，根据相关研究表明，枳壳的水提液中，柚皮苷的含量最高、新橙皮苷次之、异柚皮苷最低[2]。通过紫外光谱法，对黄酮类化合物的结构进行了测定。最终发现，多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱有两部分组成，根据峰位、峰形及吸收强度的差异，故推测出黄酮类化合物的光谱吸收如表1.1所示
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