秦岭凹叶厚朴内生真菌有益生物学特征评价(附件)
摘 要本篇文章的研究内容是从秦岭凹叶厚朴中分离获得100株内生真菌，经过对内生菌种类辨别和一些菌株培养到后期挑选80株内生菌进入分离与纯化步骤，对内生菌的形态进行观察以及利用菌株产生长素的测定、菌株溶磷能力的测定以及菌株平皿促发芽和促生实验等方法证明其代谢产物中存在一些有益于药物研究的物质，以此来完成内生真菌的有益生物学特征评价和内生真菌的与病原菌相关性的研究。
目 录
1绪论 1
1.1凹叶厚朴 1
1.2厚朴酚 1
1.2.1厚朴酚的物理性质 1
1.2.2厚朴酚的药理作用 1
1.3内生菌 2
1.3.1 内生菌的历史 3
1.3.2内生菌的分类 4
1.3.3应用 4
1.4内生真菌 6
1.4.1内生真菌的多样性 6
1.4.2内生真菌与宿主植物的关系 6
2内生菌的有益生物学特征评价 9
2.1材料 9
2.1.1植物材料 9
2.1.2仪器与试剂 9
2.2实验方法 9
2.2.1内生真菌的分离方法 9
2.2.2ACC脱氨酶活性的测定 9
2.2.3菌株产生长素测定 10
2.2.4菌株溶磷能力测定 10
2.2.5菌株固氮能力测定 10
2.2.6菌株产铁载体定量测定 10
2.2.7菌株平皿促发芽和促生试验 10
2.2.8内生菌对厚朴酚和和厚朴酚合成的影响试验 10
2.2.8内生菌与宿主治病菌之间的关系 11
2.3结果与分析 11
2.3.1分离结果 11
2.3.2结果分析 11
3结论与展望 12
参考文献 14
致 谢 16
1绪论
1.1凹叶厚朴
凹叶厚朴[Magnoliaoffcinalissubspbiloba(Rehd.etWils.)ChengetLaw.]是我国特有的非常名贵的一种药用植物，属于国家Ⅱ级重点保护野 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
生植物，疏散在华东地区、中南地区、华中地区、华南地区等地区的部分省份，而厚朴还在陕西省、甘肃省、四川盆地等地，现在有些地方已多栽培。凹叶厚朴是厚朴的亚种,是属于木兰科的,落叶乔木，高度为十五米，植株直径为四十厘米。凹叶厚朴与厚朴最不同的地方是它的皮比较薄，叶片小而窄，像倒卵形，叶子顶端有显眼凹缺口。叶子顶端那块形成的两钝圆不是很深的裂口是两者独一无二的不同点，一般情况下叶较小，侧脉较少，聚合果顶端较狭尖。凹叶厚朴的树皮也可以作厚朴药用。树皮入药功效同厚朴相比稍微差一点，花蕾、种子也可以入药。凹叶厚朴的生物特性为小枝粗壮，幼时是有绢毛的。凹叶厚朴的花在顶端是一朵一朵的形式存在的，直径1015cm，花的颜色为白色，花的味道比较香，与叶一起长出来。花期为56个月，果期为810个月。厚朴树皮中含有的木脂体类化合物包括厚朴酚、和厚朴酚和厚朴新酚、6’O甲基和厚朴酚（6’－Omethylhonokiol）、厚朴醛（magnaldehyde）B、C, 厚朴木脂体（magnolignan）A、B、C、D、E及台湾檫木醛（randainal）。
1.2厚朴酚
1.2.1厚朴酚的物理性质
本品颜色是棕褐色至白色精细粉末，闻起来是香的，味辛辣，微苦。单体为无色针状结晶体（水），熔点为102℃。溶于苯、乙醚、丙酮及一些在实验室里经常用的有机溶剂，厚朴酚在水里是很难溶解的，易溶于苛性碱稀溶液，而得到钠盐。
1.2.2厚朴酚的药理作用
（1）它在抗中枢性肌肉松弛和中枢神经抑制作用方面比较明显，且时间比较长。
（2）在抗炎症、抗菌、抗病原微生物、抗溃疡、抗肿瘤、抑制吗啡的戒断反应以及可抑制血小板的聚集。还可以用于急/慢性肠炎、细菌性或阿米巴痢疾等的治疗。在抗菌作用方面，厚朴酚对格兰氏阳性菌、耐酸性菌、丝状真菌有明显的抗菌活性，对变形链球菌有更加显著的抗菌作用，对葡萄球菌的抑制作用最强。
(3)临床方面主要用作胸腹满闷的消除、镇静中枢神经、抑制肌肉松弛、抗真菌、抗溃疡等药。
厚朴的乙醚和甲醇提取物对致龋菌、变形链球菌有强抗菌作用，其抗菌活性成分确定为厚朴酚与和厚朴酚。二者对变形链球菌的最低抑菌浓度(MIC)为6.3μg /ml，其对变形链球菌比黄连素的抗菌方面更强些。初步提取出来的厚朴碱与厚朴挥发油的饱和水溶液对金黄色葡萄球菌、八叠球菌和枯草杆菌有一定的抑制功效。厚朴对肺炎双球菌和痢疾杆菌也有一定抗菌活性，在抗菌、抗溃疡、抗痉挛、抗过敏、抗肌肉松弛等方面也有作用。近20年以来，内生真菌以其丰富的物种多样性、结构和功能多样性的次生代谢产物以及菌株生态学方面的前所未知的生态学作用，越来越受到科研人员的重视，成为了近年来菌株学、天然代谢产物和菌株生态学的研究热点[1]。根据近几年的研讨得知，厚朴含有挥发油性成分达三十多种，酚性化合物有二十余种，这些都是人类防治疾病工作来研发药物的宝贵原料，由于对森林的大量砍伐和把树皮去掉药用，招致散布面积急剧下降，成年野生植株极少见，凹叶厚朴的濒危情况跟厚朴相同[24]。
1.3内生菌
内生菌是指在它生命史的一定阶段或全部阶段，生存在健壮植物的各种组织和器官的细胞内间隙或细胞中的细菌，可以通过组织学方法或从消毒的植物完好组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物遗传物质的方法来说明内生菌的存在。内生菌对昆虫具有一定的驱避作用，在植物体内一般都存在内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识[5]。内生菌与药用植物的“协同进化”关系决定了某些内生菌具有产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力。内生菌产生的活性物质，在生物制药、农业生产、发酵等方面都体现出良好的应用前景，受到业界广泛关注。
不同产地独特的内生菌种群和群落结构特征很可能赋予了不同产地一些中药材独有的品质特点，在内生菌的研究方向上，国内侧重于内生菌产生与宿主植物相同或类似的活性产物上，国外则侧重于一些经济作物抗病害，以及在一些牧草中所含的内生菌代谢产物对牲畜方面产生什么影响的研究[6]；在研究深度上，针对内生菌与宿主植物关系的研究大多停留在表观水平上，鲜有涉及作用机制研究；第二代高通量测序技术中的环境微生物宏测序技术可以获得传统培养方法无法分离纯化得到的内生菌的基因信息，使我们能更加全面、准确地获得内生菌的相关信息；另外，转录组测序技术的应用能帮助我们深入研究内生菌与宿主植物相互作用的分子机制，使内生菌与宿主植物关系研究更深入，内生菌与宿主植物关系研究可以对中药材的人工栽培种植技术产生指导作用，阐明内生菌与宿主植物相互作用的机制。可以帮助我们更加深入和清晰地理解中药材道地性等科学内涵，也可以为内生菌技术在提高中药材品质方面的应用打下基础。我们都知道内生菌普遍存在于健康植物组织中，是植物微生态系统的重要组成部分，内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与寄主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生的关系。一方面内生真菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；另一方面，内生真菌产生的代谢物或能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中，彼此构成了稳定的生态关系。Strobel认为内生菌通过产生一些特殊的化合物来保护宿主，这些化合物有些可以调节植物生长，有些具有抗病虫害活性或者能够增加抗逆性，从而进一步影响到植物组织内的生态群落，另外有观点认为内生菌与宿主间还存在基因交换。
目 录
1绪论 1
1.1凹叶厚朴 1
1.2厚朴酚 1
1.2.1厚朴酚的物理性质 1
1.2.2厚朴酚的药理作用 1
1.3内生菌 2
1.3.1 内生菌的历史 3
1.3.2内生菌的分类 4
1.3.3应用 4
1.4内生真菌 6
1.4.1内生真菌的多样性 6
1.4.2内生真菌与宿主植物的关系 6
2内生菌的有益生物学特征评价 9
2.1材料 9
2.1.1植物材料 9
2.1.2仪器与试剂 9
2.2实验方法 9
2.2.1内生真菌的分离方法 9
2.2.2ACC脱氨酶活性的测定 9
2.2.3菌株产生长素测定 10
2.2.4菌株溶磷能力测定 10
2.2.5菌株固氮能力测定 10
2.2.6菌株产铁载体定量测定 10
2.2.7菌株平皿促发芽和促生试验 10
2.2.8内生菌对厚朴酚和和厚朴酚合成的影响试验 10
2.2.8内生菌与宿主治病菌之间的关系 11
2.3结果与分析 11
2.3.1分离结果 11
2.3.2结果分析 11
3结论与展望 12
参考文献 14
致 谢 16
1绪论
1.1凹叶厚朴
凹叶厚朴[Magnoliaoffcinalissubspbiloba(Rehd.etWils.)ChengetLaw.]是我国特有的非常名贵的一种药用植物，属于国家Ⅱ级重点保护野 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
生植物，疏散在华东地区、中南地区、华中地区、华南地区等地区的部分省份，而厚朴还在陕西省、甘肃省、四川盆地等地，现在有些地方已多栽培。凹叶厚朴是厚朴的亚种,是属于木兰科的,落叶乔木，高度为十五米，植株直径为四十厘米。凹叶厚朴与厚朴最不同的地方是它的皮比较薄，叶片小而窄，像倒卵形，叶子顶端有显眼凹缺口。叶子顶端那块形成的两钝圆不是很深的裂口是两者独一无二的不同点，一般情况下叶较小，侧脉较少，聚合果顶端较狭尖。凹叶厚朴的树皮也可以作厚朴药用。树皮入药功效同厚朴相比稍微差一点，花蕾、种子也可以入药。凹叶厚朴的生物特性为小枝粗壮，幼时是有绢毛的。凹叶厚朴的花在顶端是一朵一朵的形式存在的，直径1015cm，花的颜色为白色，花的味道比较香，与叶一起长出来。花期为56个月，果期为810个月。厚朴树皮中含有的木脂体类化合物包括厚朴酚、和厚朴酚和厚朴新酚、6’O甲基和厚朴酚（6’－Omethylhonokiol）、厚朴醛（magnaldehyde）B、C, 厚朴木脂体（magnolignan）A、B、C、D、E及台湾檫木醛（randainal）。
1.2厚朴酚
1.2.1厚朴酚的物理性质
本品颜色是棕褐色至白色精细粉末，闻起来是香的，味辛辣，微苦。单体为无色针状结晶体（水），熔点为102℃。溶于苯、乙醚、丙酮及一些在实验室里经常用的有机溶剂，厚朴酚在水里是很难溶解的，易溶于苛性碱稀溶液，而得到钠盐。
1.2.2厚朴酚的药理作用
（1）它在抗中枢性肌肉松弛和中枢神经抑制作用方面比较明显，且时间比较长。
（2）在抗炎症、抗菌、抗病原微生物、抗溃疡、抗肿瘤、抑制吗啡的戒断反应以及可抑制血小板的聚集。还可以用于急/慢性肠炎、细菌性或阿米巴痢疾等的治疗。在抗菌作用方面，厚朴酚对格兰氏阳性菌、耐酸性菌、丝状真菌有明显的抗菌活性，对变形链球菌有更加显著的抗菌作用，对葡萄球菌的抑制作用最强。
(3)临床方面主要用作胸腹满闷的消除、镇静中枢神经、抑制肌肉松弛、抗真菌、抗溃疡等药。
厚朴的乙醚和甲醇提取物对致龋菌、变形链球菌有强抗菌作用，其抗菌活性成分确定为厚朴酚与和厚朴酚。二者对变形链球菌的最低抑菌浓度(MIC)为6.3μg /ml，其对变形链球菌比黄连素的抗菌方面更强些。初步提取出来的厚朴碱与厚朴挥发油的饱和水溶液对金黄色葡萄球菌、八叠球菌和枯草杆菌有一定的抑制功效。厚朴对肺炎双球菌和痢疾杆菌也有一定抗菌活性，在抗菌、抗溃疡、抗痉挛、抗过敏、抗肌肉松弛等方面也有作用。近20年以来，内生真菌以其丰富的物种多样性、结构和功能多样性的次生代谢产物以及菌株生态学方面的前所未知的生态学作用，越来越受到科研人员的重视，成为了近年来菌株学、天然代谢产物和菌株生态学的研究热点[1]。根据近几年的研讨得知，厚朴含有挥发油性成分达三十多种，酚性化合物有二十余种，这些都是人类防治疾病工作来研发药物的宝贵原料，由于对森林的大量砍伐和把树皮去掉药用，招致散布面积急剧下降，成年野生植株极少见，凹叶厚朴的濒危情况跟厚朴相同[24]。
1.3内生菌
内生菌是指在它生命史的一定阶段或全部阶段，生存在健壮植物的各种组织和器官的细胞内间隙或细胞中的细菌，可以通过组织学方法或从消毒的植物完好组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物遗传物质的方法来说明内生菌的存在。内生菌对昆虫具有一定的驱避作用，在植物体内一般都存在内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识[5]。内生菌与药用植物的“协同进化”关系决定了某些内生菌具有产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力。内生菌产生的活性物质，在生物制药、农业生产、发酵等方面都体现出良好的应用前景，受到业界广泛关注。
不同产地独特的内生菌种群和群落结构特征很可能赋予了不同产地一些中药材独有的品质特点，在内生菌的研究方向上，国内侧重于内生菌产生与宿主植物相同或类似的活性产物上，国外则侧重于一些经济作物抗病害，以及在一些牧草中所含的内生菌代谢产物对牲畜方面产生什么影响的研究[6]；在研究深度上，针对内生菌与宿主植物关系的研究大多停留在表观水平上，鲜有涉及作用机制研究；第二代高通量测序技术中的环境微生物宏测序技术可以获得传统培养方法无法分离纯化得到的内生菌的基因信息，使我们能更加全面、准确地获得内生菌的相关信息；另外，转录组测序技术的应用能帮助我们深入研究内生菌与宿主植物相互作用的分子机制，使内生菌与宿主植物关系研究更深入，内生菌与宿主植物关系研究可以对中药材的人工栽培种植技术产生指导作用，阐明内生菌与宿主植物相互作用的机制。可以帮助我们更加深入和清晰地理解中药材道地性等科学内涵，也可以为内生菌技术在提高中药材品质方面的应用打下基础。我们都知道内生菌普遍存在于健康植物组织中，是植物微生态系统的重要组成部分，内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与寄主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生的关系。一方面内生真菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；另一方面，内生真菌产生的代谢物或能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中，彼此构成了稳定的生态关系。Strobel认为内生菌通过产生一些特殊的化合物来保护宿主，这些化合物有些可以调节植物生长，有些具有抗病虫害活性或者能够增加抗逆性，从而进一步影响到植物组织内的生态群落，另外有观点认为内生菌与宿主间还存在基因交换。
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