秦岭凹叶厚朴内生真菌对厚朴酚合成的影响研究(附件)
摘 要 本文从秦岭凹叶厚朴中分离并鉴定出38株内生真菌，分属1纲、3目、4科、8属；根部分离出内生真菌36种，根部分离出29种，叶里面分离出20种，结果表明组织器官的生长环境和器官年龄对内生真菌的种类和数量都会造成一定的影响。利用HPLC法对凹叶厚朴内生真菌的代谢产物进行研究分析，发现有5株产厚朴酚；同时将内生真菌代谢厚朴酚产量和无菌凹叶厚朴愈伤组织产厚朴酚量相比较，结果显示内生真菌代谢产厚朴酚量明显高于无菌愈伤组织的厚朴酚产量。不同组织部分的内生真菌产厚朴酚的产量也存在差异，根部产量最多，为4.907 ug/mL；茎次之，为4.126 ug/mL；叶最少，为3.025 ug/mL。
目 录
1 绪论 1
1.1 引言 1
1.2 国内外研究现状 1
1.2.1 生物碱类 1
1.2.2 酚类化合物 2
1.2.3 其他成分 2
1.3 厚朴酚的药理作用 2
1.3.1 抗炎作用 2
1.3.2 抗菌作用 3
1.3.3 抗氧化作用 3
1.3.4 抗癌作用 3
1.4 厚朴酚的提取分析法 4
1.5 研究目的、内容及其意义 4
1.5.1 研究目的 4
1.5.2 研究内容 4
1.5.3 研究意义 4
2 实验部分 6
2.1 材料 6
2.1.1 样本 6
2.1.2 主要试剂 6
2.1.3 仪器设备 6
2.1.4 培养基配方 7
2.2 凹叶厚朴内生真菌合成厚朴酚实验及结果 7
2.2.1 凹叶厚朴内生真菌的筛选 7
2.3 凹叶厚朴内生菌合成厚朴酚 10
2.3. 1 实验步骤 10
2.3.2 实验结果 11
3 结论与展望 13
3.1 结论 13
3.2 展望 13
参考文献 14
1 绪论
1.1凹叶厚朴与厚朴酚
1.1.1凹叶厚朴
凹 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
叶厚朴[Magnolia officinalis subsp. biloba(Rehd. et Wils.) Law.]是厚朴的亚种，属于我国特有的名贵药用植物。从凹叶厚朴中能提取出多种多样的活性成分，如厚朴酚、和厚朴酚、木兰碱等，其中活性作用最强且应用最为广泛的是厚朴酚[1,2]。厚朴作为珍惜树种，用途广泛，但由于过度剥皮和盲目砍伐现象的存在，厚朴数量急剧减少，野生植株极为少见，现已被列为国家II级重点保护野生植物。
1.1.2厚朴酚的药理作用
厚朴酚是从凹叶厚朴中提取活性成分之一，同时凹叶厚朴中活性作用最强且应用最为广泛的就是厚朴酚，具有抗炎[3]、抗氧化[46]、抑制肿瘤生长[7]等药理作用。
1.1.2.1 抗炎作用
厚朴酚在镇痛抗炎方面能发挥一定的药用价值。梁统等通过以大鼠胸腔白细胞为生物基础，论述厚朴酚对花生四烯酸代谢酶活性的影响，实验结果显示，厚朴酚对5 LO和环氧化酶有显著的抑制效果 [8]。李杰萍等以大鼠中性粒细胞为研究基础发现，当厚朴酚加入量大于10 umol/L 时，厚朴酚能够抑制中性粒细胞β葡糖苷酸酶和溶菌酶的酶活性，起到抗炎的功效 [9]。Kuo等在研究人类中性粒细胞产生的活性氧（ROS）和颗粒蛋白酶抗炎机制时发现，厚朴树皮中提取的厚朴酚对人中性粒细胞弹性蛋白酶的释放有抑制作用[10]。
1.1.2.2 抗菌作用
1983年，Tsuneo等对从生物中提取出来的60多种药品进行筛选，这些药品都产自中国和日本，最后筛选出了有效对抗致龋菌厚朴酚和日本厚朴酚。厚朴酚抗菌作用的研究得到了多方证实。多方研究表明厚朴酚对多种致龋菌[11]、人类病原细菌[12]、多种植物病原真菌[13]都有抑制作用。金志强等研究厚朴酚对13种临床常见病原菌的体外抑菌活性的实验时，结果显示，厚朴酚在不同程度上能有效抑制13种临床常见病原菌的生长，尤其是对葡萄球菌（MIC为160 ug/mL）抑制作用效果最好[14]。李慧利用EMAP实验证实了厚朴酚可以通过抑制菌细胞壁合成酶的活性，从而达到抑菌效果[15]。Bang等从日本厚朴树皮中分离出厚朴酚，将其运用到人类真菌的治疗中，证实了厚朴酚能抗真菌，在细菌的抑菌效果，对新型隐球菌和白色念珠菌效果显著 [16]。
1.1.2.3 抗氧化作用
研究发现，厚朴酚有抗氧化作用。Park等为了调查厚朴酚和自由基对肝细胞损伤的保护作用时采用叔丁基过氧化物诱导小鼠氧化应激模型，证实了厚朴酚通过抑制脂质过氧化、清除体内自由基和增强谷胱甘肽的表达而促进抗氧化系统3种途径对小鼠肝脏损伤实现保护作用[17]。Li等将NCIH 460细胞培养基加入叔丁基过氧化氢进行处理，再加入厚朴酚进行干预，结果表明厚朴酚能够抑制脂质过氧化发挥保护作用[18]。庞月兰将厚朴酚注入小鼠体内，并测量了小鼠体内的相关酶活性，包括过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶，数据显示，相关抗氧化酶活性增强，抗氧化能力也得到提高 [19]。研究证实在植物油中添加厚朴酚，其抗氧化能力大幅提升，主要作用途径是通过脂质过氧化的抑制、自由基的清除、抗氧化酶活性的提高来发挥保护作用 [20]。
1.1.2.4抗癌作用
研究表明，厚朴酚有抗癌效果。宋义勇等发现厚朴酚能够显著抑制慢性髓性白血病细胞株K562细胞的增殖，实验中采用MMT方法，进一步的实验研究该细胞的体外作用机制得到以下结论：厚朴酚之所以能抑制K562细胞增殖是通过抑制BCL2的表达、上调Bax、细胞色素C和活化的caspase3、caspase9的表达来诱导细胞凋亡，从而抑制K562细胞增殖[21]。Tsai等在体外试验提出厚朴酚能抑制肺癌细胞增殖，保护肺部[22]。此外，在胃癌[23]、乳腺癌[24]、鼻咽癌[25]等抗癌研究中证实了厚朴酚的重要作用。
1.2植物内生真菌
内生真菌（Endophytic fungi）是一个特殊的微生物类群，其种类丰富多样，在各类药用植物中广泛分布。大量的研究结果证实，基本上全部的药用植物内都能分离到内生真菌。在生物发展史上，内生真菌能产生及其丰富的代谢产物。在内生真菌的作用下，宿主植物具备进行合成次生代谢产物的能力。两种所产生的药用活性成分在生理功用方面保持相同性或者一定的相似性，同时寄生的内生真菌能够合成信号物质能够影响植物的代谢活动。
1.2.1内生真菌
植物内生真菌在健康植物组织中生活，但不会对宿主植物带来显著的感染症状。自1898年，Vogol等从黑麦草种子组织内部分离出内生真菌，拉开了植物内生真菌的研究的序幕，迄今为止已有100多年，而关于药用植物内生真菌的探讨关注的历史仅有30年。药用植物内生真菌在数量和种类方面特别的丰富多样，不仅能够发挥合成多种次级代谢物的作用，自身还能发挥显著的药用生物活性。内生真菌与宿主植物共同生活共同成长的过程中，大量的研究报道指出两者能发生基因交换活动，实现协同进化的结果。在此过程中，内生真菌获得了与宿主植物相同或相似的代谢能力，最终产生具有生物活性的物质成分从而抑制植物病原菌的生长繁殖。
目 录
1 绪论 1
1.1 引言 1
1.2 国内外研究现状 1
1.2.1 生物碱类 1
1.2.2 酚类化合物 2
1.2.3 其他成分 2
1.3 厚朴酚的药理作用 2
1.3.1 抗炎作用 2
1.3.2 抗菌作用 3
1.3.3 抗氧化作用 3
1.3.4 抗癌作用 3
1.4 厚朴酚的提取分析法 4
1.5 研究目的、内容及其意义 4
1.5.1 研究目的 4
1.5.2 研究内容 4
1.5.3 研究意义 4
2 实验部分 6
2.1 材料 6
2.1.1 样本 6
2.1.2 主要试剂 6
2.1.3 仪器设备 6
2.1.4 培养基配方 7
2.2 凹叶厚朴内生真菌合成厚朴酚实验及结果 7
2.2.1 凹叶厚朴内生真菌的筛选 7
2.3 凹叶厚朴内生菌合成厚朴酚 10
2.3. 1 实验步骤 10
2.3.2 实验结果 11
3 结论与展望 13
3.1 结论 13
3.2 展望 13
参考文献 14
1 绪论
1.1凹叶厚朴与厚朴酚
1.1.1凹叶厚朴
凹 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
叶厚朴[Magnolia officinalis subsp. biloba(Rehd. et Wils.) Law.]是厚朴的亚种，属于我国特有的名贵药用植物。从凹叶厚朴中能提取出多种多样的活性成分，如厚朴酚、和厚朴酚、木兰碱等，其中活性作用最强且应用最为广泛的是厚朴酚[1,2]。厚朴作为珍惜树种，用途广泛，但由于过度剥皮和盲目砍伐现象的存在，厚朴数量急剧减少，野生植株极为少见，现已被列为国家II级重点保护野生植物。
1.1.2厚朴酚的药理作用
厚朴酚是从凹叶厚朴中提取活性成分之一，同时凹叶厚朴中活性作用最强且应用最为广泛的就是厚朴酚，具有抗炎[3]、抗氧化[46]、抑制肿瘤生长[7]等药理作用。
1.1.2.1 抗炎作用
厚朴酚在镇痛抗炎方面能发挥一定的药用价值。梁统等通过以大鼠胸腔白细胞为生物基础，论述厚朴酚对花生四烯酸代谢酶活性的影响，实验结果显示，厚朴酚对5 LO和环氧化酶有显著的抑制效果 [8]。李杰萍等以大鼠中性粒细胞为研究基础发现，当厚朴酚加入量大于10 umol/L 时，厚朴酚能够抑制中性粒细胞β葡糖苷酸酶和溶菌酶的酶活性，起到抗炎的功效 [9]。Kuo等在研究人类中性粒细胞产生的活性氧（ROS）和颗粒蛋白酶抗炎机制时发现，厚朴树皮中提取的厚朴酚对人中性粒细胞弹性蛋白酶的释放有抑制作用[10]。
1.1.2.2 抗菌作用
1983年，Tsuneo等对从生物中提取出来的60多种药品进行筛选，这些药品都产自中国和日本，最后筛选出了有效对抗致龋菌厚朴酚和日本厚朴酚。厚朴酚抗菌作用的研究得到了多方证实。多方研究表明厚朴酚对多种致龋菌[11]、人类病原细菌[12]、多种植物病原真菌[13]都有抑制作用。金志强等研究厚朴酚对13种临床常见病原菌的体外抑菌活性的实验时，结果显示，厚朴酚在不同程度上能有效抑制13种临床常见病原菌的生长，尤其是对葡萄球菌（MIC为160 ug/mL）抑制作用效果最好[14]。李慧利用EMAP实验证实了厚朴酚可以通过抑制菌细胞壁合成酶的活性，从而达到抑菌效果[15]。Bang等从日本厚朴树皮中分离出厚朴酚，将其运用到人类真菌的治疗中，证实了厚朴酚能抗真菌，在细菌的抑菌效果，对新型隐球菌和白色念珠菌效果显著 [16]。
1.1.2.3 抗氧化作用
研究发现，厚朴酚有抗氧化作用。Park等为了调查厚朴酚和自由基对肝细胞损伤的保护作用时采用叔丁基过氧化物诱导小鼠氧化应激模型，证实了厚朴酚通过抑制脂质过氧化、清除体内自由基和增强谷胱甘肽的表达而促进抗氧化系统3种途径对小鼠肝脏损伤实现保护作用[17]。Li等将NCIH 460细胞培养基加入叔丁基过氧化氢进行处理，再加入厚朴酚进行干预，结果表明厚朴酚能够抑制脂质过氧化发挥保护作用[18]。庞月兰将厚朴酚注入小鼠体内，并测量了小鼠体内的相关酶活性，包括过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧化物歧化酶，数据显示，相关抗氧化酶活性增强，抗氧化能力也得到提高 [19]。研究证实在植物油中添加厚朴酚，其抗氧化能力大幅提升，主要作用途径是通过脂质过氧化的抑制、自由基的清除、抗氧化酶活性的提高来发挥保护作用 [20]。
1.1.2.4抗癌作用
研究表明，厚朴酚有抗癌效果。宋义勇等发现厚朴酚能够显著抑制慢性髓性白血病细胞株K562细胞的增殖，实验中采用MMT方法，进一步的实验研究该细胞的体外作用机制得到以下结论：厚朴酚之所以能抑制K562细胞增殖是通过抑制BCL2的表达、上调Bax、细胞色素C和活化的caspase3、caspase9的表达来诱导细胞凋亡，从而抑制K562细胞增殖[21]。Tsai等在体外试验提出厚朴酚能抑制肺癌细胞增殖，保护肺部[22]。此外，在胃癌[23]、乳腺癌[24]、鼻咽癌[25]等抗癌研究中证实了厚朴酚的重要作用。
1.2植物内生真菌
内生真菌（Endophytic fungi）是一个特殊的微生物类群，其种类丰富多样，在各类药用植物中广泛分布。大量的研究结果证实，基本上全部的药用植物内都能分离到内生真菌。在生物发展史上，内生真菌能产生及其丰富的代谢产物。在内生真菌的作用下，宿主植物具备进行合成次生代谢产物的能力。两种所产生的药用活性成分在生理功用方面保持相同性或者一定的相似性，同时寄生的内生真菌能够合成信号物质能够影响植物的代谢活动。
1.2.1内生真菌
植物内生真菌在健康植物组织中生活，但不会对宿主植物带来显著的感染症状。自1898年，Vogol等从黑麦草种子组织内部分离出内生真菌，拉开了植物内生真菌的研究的序幕，迄今为止已有100多年，而关于药用植物内生真菌的探讨关注的历史仅有30年。药用植物内生真菌在数量和种类方面特别的丰富多样，不仅能够发挥合成多种次级代谢物的作用，自身还能发挥显著的药用生物活性。内生真菌与宿主植物共同生活共同成长的过程中，大量的研究报道指出两者能发生基因交换活动，实现协同进化的结果。在此过程中，内生真菌获得了与宿主植物相同或相似的代谢能力，最终产生具有生物活性的物质成分从而抑制植物病原菌的生长繁殖。
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