coi基因序列分析长江各江段鲢群体遗传多样性
利用线粒体细胞色素C氧化酶 I(?cytochrome coxidase)分子标记分析长江安庆、铜陵、当涂、南通4个江段鲢(Hypophthalmichthys molitrix) 4个地理种群89个样本的遗传多样性，该基因677 bp 片段的碱基序列共检出10个核苷酸变异位点(变异率1.48%)，平均单倍型多样性(Hd)0.7114，平均核苷酸多样性（π）0.00286，显示4个江段的鲢具有丰富的遗传多样性。4个种群间平均遗传距离0.0027，安庆鲢和铜陵鲢遗传距离最大0.004，当涂鲢和南通鲢遗传距离最小0.001。不同地理种群遗传多样性差异显著；有人工移植历史种群遗传多样性较高、隔离度较高的种群遗传多样性低较但大部分的遗传变异来自于种群内，反映出地理隔离和人为干扰对鲢鱼遗传格局影响显著。
目录
摘要 . 1
关键词1
Abstract...............................1
Key words.1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.3统计分析3
2结果与分析3
2.1 mtDNA序列测定及碱基特性3
2.2单倍型分析5
2.3 种群的遗传距离5
3 讨论 6
致谢6
参考文献7
图1 采样点地图2
图2 PCR扩增后得到清晰整齐的电泳谱带4
表1 4个地理群体鲢mtDNA COI 序列的碱基组成(%) 4
表2 4个鲢群体mtDNA COI 基因突变位点及单倍型5
表3 鲢线粒体COI基因单倍型分布5
表4 鲢4个群体间遗传距离D6 基于COI基因序列分析长江各江段鲢群体遗传多样性
引言
鲢(Hypophthalmichthys molitrix)，又叫白鲢，属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidate）[1]，是著名的四大家鱼之一，鲢是典型的食浮游生物的鱼类，终生以浮游生物为食。它的适宜生长温度为2332℃，生长季节大都在江河支流和湖泊 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
中肥育。低温季节，食欲减退，但依然摄食，且多集中于河床及湖泊深处越冬。鲢分布范围较广泛，在我国各地区均有分布，是我国淡水鱼中分布最广泛的鱼类之一。鲢主要生活在水中的表层，以藻类为食。人类活动介入影响长江野生鲢鱼的生存环境，造成其生活环境的改变，致使繁殖群体变小，产卵场减少，对野生鲢鱼的遗传多样性有一定的影响。就目前来讲，鲢野生群体具有丰富的遗传多样性，有较好的选育潜力，可以作为良好的育种材料进行鲢鱼的本品种选育和新品种（系）培育，但在今后的利用和保护中应采取必要的措施来维持其遗传多样性。
鲢遗传多样性的研究已经陆续展开，如同工酶[2,3]，mtDNA Dloop区[4]，微卫星[5]等标记技术都应用于其遗传多样性的分析[68]，而有关COI基因在鲢群体遗传多样性方面的研究尚无报道。近年来，DNA条形码(DNA barcode)技术[9,10]发展迅速。线粒体DNA的COI基因因其长度适宜、进化速率慢、富含系统发育信息以及易被通用引物所扩增等特点而被广泛用于条形码分析[11,12]。基于COI基因655bp碱基片段的分析，Ward等有效地区分了澳大利亚207种海洋鱼类[13]，Schlei等对鲑科鱼类一个亚科的3个属进行鉴定[14]，王中铎等有效鉴别了南海40种硬骨鱼类[15]。以上研究表明细胞色素氧化酶基因进化速度比较快，是检测群体遗传变异和分析不同群体遗传特性中，应用较广的一种分子标记，在鱼类、虾蟹类等水产动物中都有广泛应用。可见，COI基因适宜于鲢DNA条形码分析及对鲢进行快速有效的物种鉴定。因此本研究选用COI基因标记分析了长江4个江段地理种群的遗传结构，分析4个江段鲢遗传多样性分布格局，为制定鲢鱼资源保护和增殖放流提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
2014年57月在安庆、铜陵、当涂和南通江段（图1）共随机测定鲢样本89个，其中安庆28个，铜陵29个，当涂12个，南通20个 。
图 1采样点地图
1．2 实验方法
1.2.1 基因组总 DNA 的提取
取100mg鲢背鳍组织，放入1.5ml eppendorf管中剪碎，采用OMEGA公司的E.Z.N.A.TMSE Tissue DNA Kit试剂盒法提取DNA，具体步骤为：
1).在挑选好的备提取DNA的组织样中加入460μL?STE，20μL10mg/ml?PK，20μL?SDS?10?%，?65℃完全消化1.5小时后，加入30μL无水乙醇，振荡混匀，12000转离心2分钟，将上清液至吸附柱；
2).将柱子放入2ml收集管，所得液体转入柱子，12000转离心1分钟，弃滤液；
3).加入500μL?Buffer?HB，同上离心，弃滤液；
4).加入?500μL Washing，同上离心，弃滤液，重复一次；
5).12000转2分钟，甩干柱子；
6).将柱子放入新的1.5ml Eppendorf管，加入50μL 56℃预热Elution Buffer，室温静置5分钟，12000转1分钟离心洗脱DNA，重复一次，收集好提取的DNA样品。用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度。
1.2.2 PCR 扩增与测序
扩增引物由上海铂尚生物有限公司合成，引物设计按照鲢COI 基因的片段进行设计，COI 基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为:
COIF: 5’GGACAGCCCTTAGCCTCCTCATC3’；
COIR: 5’CTGCTGGGTCGAAGAAGGTGGTGT3’。
PCR反应体系(TAKARA，大连宝生物科技有限公司)为20μL，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 10μL， 正反向引物各 lμL (20 mM/L)，DNA模板2 μL (50 ng/μL)，ddH2O补足至20μL。用Gene Company Limited的Veriti PCR仪扩增，反应共设30个循环，循环前94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s；循环结束后于72℃延伸7min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以标准100 bp DNA Ladder(TAKARA)估算产物大小。后送上海铂尚生物有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
目录
摘要 . 1
关键词1
Abstract...............................1
Key words.1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.3统计分析3
2结果与分析3
2.1 mtDNA序列测定及碱基特性3
2.2单倍型分析5
2.3 种群的遗传距离5
3 讨论 6
致谢6
参考文献7
图1 采样点地图2
图2 PCR扩增后得到清晰整齐的电泳谱带4
表1 4个地理群体鲢mtDNA COI 序列的碱基组成(%) 4
表2 4个鲢群体mtDNA COI 基因突变位点及单倍型5
表3 鲢线粒体COI基因单倍型分布5
表4 鲢4个群体间遗传距离D6 基于COI基因序列分析长江各江段鲢群体遗传多样性
引言
鲢(Hypophthalmichthys molitrix)，又叫白鲢，属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidate）[1]，是著名的四大家鱼之一，鲢是典型的食浮游生物的鱼类，终生以浮游生物为食。它的适宜生长温度为2332℃，生长季节大都在江河支流和湖泊 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
中肥育。低温季节，食欲减退，但依然摄食，且多集中于河床及湖泊深处越冬。鲢分布范围较广泛，在我国各地区均有分布，是我国淡水鱼中分布最广泛的鱼类之一。鲢主要生活在水中的表层，以藻类为食。人类活动介入影响长江野生鲢鱼的生存环境，造成其生活环境的改变，致使繁殖群体变小，产卵场减少，对野生鲢鱼的遗传多样性有一定的影响。就目前来讲，鲢野生群体具有丰富的遗传多样性，有较好的选育潜力，可以作为良好的育种材料进行鲢鱼的本品种选育和新品种（系）培育，但在今后的利用和保护中应采取必要的措施来维持其遗传多样性。
鲢遗传多样性的研究已经陆续展开，如同工酶[2,3]，mtDNA Dloop区[4]，微卫星[5]等标记技术都应用于其遗传多样性的分析[68]，而有关COI基因在鲢群体遗传多样性方面的研究尚无报道。近年来，DNA条形码(DNA barcode)技术[9,10]发展迅速。线粒体DNA的COI基因因其长度适宜、进化速率慢、富含系统发育信息以及易被通用引物所扩增等特点而被广泛用于条形码分析[11,12]。基于COI基因655bp碱基片段的分析，Ward等有效地区分了澳大利亚207种海洋鱼类[13]，Schlei等对鲑科鱼类一个亚科的3个属进行鉴定[14]，王中铎等有效鉴别了南海40种硬骨鱼类[15]。以上研究表明细胞色素氧化酶基因进化速度比较快，是检测群体遗传变异和分析不同群体遗传特性中，应用较广的一种分子标记，在鱼类、虾蟹类等水产动物中都有广泛应用。可见，COI基因适宜于鲢DNA条形码分析及对鲢进行快速有效的物种鉴定。因此本研究选用COI基因标记分析了长江4个江段地理种群的遗传结构，分析4个江段鲢遗传多样性分布格局，为制定鲢鱼资源保护和增殖放流提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
2014年57月在安庆、铜陵、当涂和南通江段（图1）共随机测定鲢样本89个，其中安庆28个，铜陵29个，当涂12个，南通20个 。
图 1采样点地图
1．2 实验方法
1.2.1 基因组总 DNA 的提取
取100mg鲢背鳍组织，放入1.5ml eppendorf管中剪碎，采用OMEGA公司的E.Z.N.A.TMSE Tissue DNA Kit试剂盒法提取DNA，具体步骤为：
1).在挑选好的备提取DNA的组织样中加入460μL?STE，20μL10mg/ml?PK，20μL?SDS?10?%，?65℃完全消化1.5小时后，加入30μL无水乙醇，振荡混匀，12000转离心2分钟，将上清液至吸附柱；
2).将柱子放入2ml收集管，所得液体转入柱子，12000转离心1分钟，弃滤液；
3).加入500μL?Buffer?HB，同上离心，弃滤液；
4).加入?500μL Washing，同上离心，弃滤液，重复一次；
5).12000转2分钟，甩干柱子；
6).将柱子放入新的1.5ml Eppendorf管，加入50μL 56℃预热Elution Buffer，室温静置5分钟，12000转1分钟离心洗脱DNA，重复一次，收集好提取的DNA样品。用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，紫外分光光度法检测样品DNA浓度及纯度。
1.2.2 PCR 扩增与测序
扩增引物由上海铂尚生物有限公司合成，引物设计按照鲢COI 基因的片段进行设计，COI 基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为:
COIF: 5’GGACAGCCCTTAGCCTCCTCATC3’；
COIR: 5’CTGCTGGGTCGAAGAAGGTGGTGT3’。
PCR反应体系(TAKARA，大连宝生物科技有限公司)为20μL，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 10μL， 正反向引物各 lμL (20 mM/L)，DNA模板2 μL (50 ng/μL)，ddH2O补足至20μL。用Gene Company Limited的Veriti PCR仪扩增，反应共设30个循环，循环前94℃预变性3min，每个循环包括94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s；循环结束后于72℃延伸7min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以标准100 bp DNA Ladder(TAKARA)估算产物大小。后送上海铂尚生物有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
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