日本沼虾中βglucosidase23克隆和表达研究
将日本沼虾(Macrobrachium nipponense)促雄腺转录组文库与输精管、精巢及卵巢转录组进行比较分析后，发现了一个与β-葡萄糖苷酶23(β-glucosidase 23)基因高度同源的基因序列，其在促雄腺中特异表达且表达量极高，基于促雄腺在甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持方面中的重要作用，推断β-葡萄糖苷酶23（Mn β-23）可能为日本沼虾性别相关候选基因。本研究通过RACE克隆和qRT-PCR技术对Mn β-23基因在日本沼虾中的功能进行初步分析。结果表明，Mn β-23 基因cDNA序列全长为2,691bp，包含1,572bp的开放阅读框，编码524个氨基酸。Mn β-23的二级结构包含37.4%螺旋结构、12.79%的直链结构以及49.81%的环形结构。相似度分析和系统进化树结果表明，该基因与拟南芥（Arabidopsis thaliana）β-glucosidase23的序列相似度最高，达到100%。不同成体组织qRT-PCR分析表明，Mn β-23在肝脏和眼柄中的表达量极高且显著高于其他组织（P<0.05），包括促雄腺、精巢及卵巢，因此该基因可能与免疫系统有关。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1. 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 实验用虾 3
1.1.2 试剂 4
1.1.3 仪器 4
1.2 方法 4
1.2.1 日本沼虾精巢卵巢组织总RNA的提取 4
1.2.2 日本沼虾Mn β23基因cDNA序列全长克隆 4
1.2.3 PCR产物的切胶回收克隆测序 5
1.2.4 生物信息学分析 6
1.2.5 日本沼虾Mn β23基因不同成体组织定量表达研究 6
2.结果与分析 7
2.1 Mn β23的序列分析 7
2.2 生物信息分析 9
2.3 相似性比较和种系发生（进化）分析 9
2.4 Mn β23 mRNA的组织分布 11
3.讨论 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
致谢 12
参考文献: 12
日本沼虾中βglucosidase 23克隆和表达研究
引言
青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense) (图1)，隶属于十足目、长臂虾科、沼虾属，是我国重要的淡水经济虾类品种。日本沼虾主要生活在淡水水域，以淡水湖、河、池、沼中为主，在我国各地均有分布，但主养区主要集中在江苏、上海、浙江、安徽、江西等省份。据2015年《中国渔业年鉴》公布，2014年日本沼虾养殖产量25.7万吨，日本沼虾养殖业年产值超过200亿元，是我国水产养殖业的重要组成部分。日本沼虾肉质细嫩、味道鲜美，经济价值高，适应性强，生长速度快，繁殖能力强等特点，深受广大消费者和养殖户的欢迎，是我国具有代表性的优质水产品之一，在农业增效和农民增收方面发挥了十分突出的作用。
图 1 日本沼虾（Macrobrachium nipponense）
Figure 1 Oriental river prawn (Macrobrachium nipponense)
沼虾属的许多物种均存在明显的雌性生长差异现象(Sagi et al, 1986) [1]，即雄虾的生长速度及个体大小明显优于雌虾，故养殖效益也存在较大的差异。雄性日本沼虾的生长速度显著快于雌性日本沼虾，商品雄虾的规格为雌虾的22.5倍，因此全雄化养殖具有广泛的应用前景以及巨大的经济价值。
促雄腺（androgenic gland）是雄性甲壳动物特有的内分泌腺组织，与性别分化、雄性发育及维持有关，在甲壳类性别调控中发挥着关键作用。其最先在美洲蓝蟹(Callinectes sapidus)中发现（Cronin, 1947）[2]。随后，促雄腺在一系列甲壳类动物中被报道发现，包括日本沼虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等我国重要的淡水甲壳类经济品种。一系列研究表明，甲壳动物在早期发育过程中具有向两性发育的潜能，而促雄腺与性别分化、雄性发育及维持有关，在甲壳类性别调控中发挥着关键作用(Tomer et al, 2009) [3]。同时，研究表明，促雄腺在雄性分化过程中的重要功能主要是通过其分泌的IAG(insulinlike androgenic gland specific factor)激素来实现的。
采用Illumina Hiseq2000 测序平台构建日本沼虾促雄腺转录组文库。拼接后共产生78,408条转录本，核酸序列长度从351bp到23,271bp；过滤后共获得57,619个基因，平均核酸序列长度为1,244.19bp。根据日本沼虾促雄腺转录组中基因的功能注释，共筛选到47个与其它物种性别决定和性别分化基因高度同源的基因或基因家族，包括IAG、sxl、Tra2等。通过将促雄腺转录组文库与日本沼虾输精管、精巢及卵巢转录组进行比较分析后，共筛选得到促雄腺高表达基因40个，为日本沼虾性别相关的候选基因，其中24个基因为促雄腺特异表达，剩余的16个基因与IAG基因具有相似的表达模式，其特点为在促雄腺中的表达量极高，但在输精管、精巢和卵巢中的表达量极低。在日本沼虾促雄腺转录组中发现了一个与β葡萄糖苷酶23(βglucosidase)基因高度同源的基因序列，其在促雄腺中特异表达且表达量极高，达到5577，基于促雄腺在甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持方面所起的重要作用，故推断，β葡萄糖苷酶23可能为日本沼虾性别相关新基因。
生物学上关于β葡萄糖苷酶的研究始于1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁(Armeniaca sibirica)汁中发现了β葡萄糖苷酶。β葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是βglucosidase，属于水解酶类。 随后Lymar E S[4]，KiBong O H[5]，GuevasL[6]，Podstolski，Heuser W，Grover A K，J H Schreier，Ashock K Grover，Nadia AIT，Shoeyov，Martine L等[7]先后分离纯化了该酶且进行研究，并从黑樱桃(Cerasus maximowiczi)[8]、水稻(Oryza?sativa)[9]、大豆(Glycine max)[10]、木薯?(Manihot esculenta)[11,12]等植物中分析纯化出了βglucosidase。除植物外，目前βglucosidase在微生物中的也有研究，主要在酵母、细菌、真菌、链霉菌等中[7]。目前为止，研究已发现，βglucosidase广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，或者也可来源于动物[13]（几乎所有生物）。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1. 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 实验用虾 3
1.1.2 试剂 4
1.1.3 仪器 4
1.2 方法 4
1.2.1 日本沼虾精巢卵巢组织总RNA的提取 4
1.2.2 日本沼虾Mn β23基因cDNA序列全长克隆 4
1.2.3 PCR产物的切胶回收克隆测序 5
1.2.4 生物信息学分析 6
1.2.5 日本沼虾Mn β23基因不同成体组织定量表达研究 6
2.结果与分析 7
2.1 Mn β23的序列分析 7
2.2 生物信息分析 9
2.3 相似性比较和种系发生（进化）分析 9
2.4 Mn β23 mRNA的组织分布 11
3.讨论 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
致谢 12
参考文献: 12
日本沼虾中βglucosidase 23克隆和表达研究
引言
青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense) (图1)，隶属于十足目、长臂虾科、沼虾属，是我国重要的淡水经济虾类品种。日本沼虾主要生活在淡水水域，以淡水湖、河、池、沼中为主，在我国各地均有分布，但主养区主要集中在江苏、上海、浙江、安徽、江西等省份。据2015年《中国渔业年鉴》公布，2014年日本沼虾养殖产量25.7万吨，日本沼虾养殖业年产值超过200亿元，是我国水产养殖业的重要组成部分。日本沼虾肉质细嫩、味道鲜美，经济价值高，适应性强，生长速度快，繁殖能力强等特点，深受广大消费者和养殖户的欢迎，是我国具有代表性的优质水产品之一，在农业增效和农民增收方面发挥了十分突出的作用。
图 1 日本沼虾（Macrobrachium nipponense）
Figure 1 Oriental river prawn (Macrobrachium nipponense)
沼虾属的许多物种均存在明显的雌性生长差异现象(Sagi et al, 1986) [1]，即雄虾的生长速度及个体大小明显优于雌虾，故养殖效益也存在较大的差异。雄性日本沼虾的生长速度显著快于雌性日本沼虾，商品雄虾的规格为雌虾的22.5倍，因此全雄化养殖具有广泛的应用前景以及巨大的经济价值。
促雄腺（androgenic gland）是雄性甲壳动物特有的内分泌腺组织，与性别分化、雄性发育及维持有关，在甲壳类性别调控中发挥着关键作用。其最先在美洲蓝蟹(Callinectes sapidus)中发现（Cronin, 1947）[2]。随后，促雄腺在一系列甲壳类动物中被报道发现，包括日本沼虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等我国重要的淡水甲壳类经济品种。一系列研究表明，甲壳动物在早期发育过程中具有向两性发育的潜能，而促雄腺与性别分化、雄性发育及维持有关，在甲壳类性别调控中发挥着关键作用(Tomer et al, 2009) [3]。同时，研究表明，促雄腺在雄性分化过程中的重要功能主要是通过其分泌的IAG(insulinlike androgenic gland specific factor)激素来实现的。
采用Illumina Hiseq2000 测序平台构建日本沼虾促雄腺转录组文库。拼接后共产生78,408条转录本，核酸序列长度从351bp到23,271bp；过滤后共获得57,619个基因，平均核酸序列长度为1,244.19bp。根据日本沼虾促雄腺转录组中基因的功能注释，共筛选到47个与其它物种性别决定和性别分化基因高度同源的基因或基因家族，包括IAG、sxl、Tra2等。通过将促雄腺转录组文库与日本沼虾输精管、精巢及卵巢转录组进行比较分析后，共筛选得到促雄腺高表达基因40个，为日本沼虾性别相关的候选基因，其中24个基因为促雄腺特异表达，剩余的16个基因与IAG基因具有相似的表达模式，其特点为在促雄腺中的表达量极高，但在输精管、精巢和卵巢中的表达量极低。在日本沼虾促雄腺转录组中发现了一个与β葡萄糖苷酶23(βglucosidase)基因高度同源的基因序列，其在促雄腺中特异表达且表达量极高，达到5577，基于促雄腺在甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持方面所起的重要作用，故推断，β葡萄糖苷酶23可能为日本沼虾性别相关新基因。
生物学上关于β葡萄糖苷酶的研究始于1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁(Armeniaca sibirica)汁中发现了β葡萄糖苷酶。β葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是βglucosidase，属于水解酶类。 随后Lymar E S[4]，KiBong O H[5]，GuevasL[6]，Podstolski，Heuser W，Grover A K，J H Schreier，Ashock K Grover，Nadia AIT，Shoeyov，Martine L等[7]先后分离纯化了该酶且进行研究，并从黑樱桃(Cerasus maximowiczi)[8]、水稻(Oryza?sativa)[9]、大豆(Glycine max)[10]、木薯?(Manihot esculenta)[11,12]等植物中分析纯化出了βglucosidase。除植物外，目前βglucosidase在微生物中的也有研究，主要在酵母、细菌、真菌、链霉菌等中[7]。目前为止，研究已发现，βglucosidase广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，或者也可来源于动物[13]（几乎所有生物）。
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