2个地理种群大银鱼coⅰ基因序列变异与遗传分化
测定了太湖、洪泽湖2个种群共计96 尾大银鱼线粒体细胞色素 C 氧化酶Ⅰ亚基 (cytochrome oxidaseⅠ,COⅠ)基因的部分序列。结果表明，在638bp 序列中，共检测到6个变异位点，约占核苷酸总数的0.94％。A、G、T、C的平均含量依次为26.2%、34.0%、21.3%和18.5%，A + T的含量 (44.7％) 低于G + C的含量(55.3％)。单倍型分析中，共发现7种单倍型,其中hap1，hap5和hap7为共享单倍型，hap6为洪泽湖种群特有，hap2，hap3和hap4为太湖种群特有；在7种单倍型中，hap1为明显的优势单倍体型，共54个样本（占样本总数的56.25%）。平均单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.642和0.00148，表现出较低的遗传多样性。AMOVA分析显示，种群内遗传变异为79.82%，种群间变异为20.18%。两种群间遗传分化系数Fst为0.20179，基因交流值Nm为1.97782，表明两种群间遗传分化程度较高，且有一定的基因交流。其结果可以为合理开发和利用大银鱼野生资源,建立大银鱼种质资源库提供必要的参考。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1样本采集 2
1.2 基因组DNA提取与目的基因扩增测序 2
1.2.1基因组DNA提取 2
1.2.2目的基因扩增与测序 2
1.3数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1大银鱼群体COⅠ基因序列多样性 3
2.2单倍型分析 4
2.3种群遗传多样性分析 4
2.4种群遗传距离和AMOVA分析 5
3讨论 5
3.1关于COⅠ基因 5
3.2大银鱼单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi） 5
3.3大银鱼种群中性检验（Tajima D检验） 6
3.4大银鱼2种群间的遗传分化及基因交流 6
致谢 6
参考文献 6
2个地理种群大银鱼C *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
OⅠ基因序列变异与遗传分化
引言
大银鱼(protosalanx hyaloeranius)属硬骨鱼纲(Osteicthyes)，胡瓜鱼目Osmeriformes)，银鱼科(Salangidae)，大银鱼亚科(Protosalanginae)，大银鱼属(Protosalanx Regan)。大银鱼体长一般为11~16cm，成鱼吻部扁平而尖，呈三角形，下颌稍长于上颌，一年生，繁殖能力强，具有较高的研究价值；大银鱼分布在长江、淮河中下游河道和湖泊水库，在东海、黄海、渤海沿海也有分布，是我国银鱼科中分布较广、产量较高且经济价值较高的经济鱼类。大银鱼是太湖、洪泽湖的传统名特产之一，也是江苏省出口创汇的重要水产品。关于大银鱼的研究主要集中在生物学特性［1］、移殖增殖［2］、种群生态方面［3］，分子方面的研究较少［47］。
线粒体基因具有单一的母性遗传模式，无内含子且几乎不发生重组，与核基因相比，更适合作为DNA 条形码标准标记［8］。Hebert在研究中发现，线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ) 基因序列两端保守性较高，序列的进化速率较快，且引物的通用性高［9］，认为其可以反映物种之间真实的进化关系，因此提出可以利用该特定基因序列进行动物DNA条形编码工作［10］。Ward等通过对COⅠ基因进行分析，有效地对了澳大利亚207种海洋鱼类进行了区分［11］，Schlei等鉴别了鲑科鱼类一个亚科中的3个属［12］，王中铎等也通过COⅠ基因分析，对南海的40种硬骨鱼类进行了有效鉴定［13］。雷光春等度太湖新银鱼COⅠ基因遗传多样性分析也为本研究提供了重要启示［14］。本研究测定了我国太湖和洪泽湖2个地理种群的大银鱼COⅠ基因部分序列，对其遗传结构和遗传多样性进行分析，研究结果有望为大银鱼种质资源的保护和开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 样本采集
本实验大银鱼样本为2014年5月至 2014年9月间采集于太湖(编号为TH)、洪泽湖(编号为HZH)。样品采集后立即用冰盒带回实验室，并保存在 95％乙醇中备用。
1.2 基因组DNA提取与目的基因扩增测序
1.2.1基因组DNA提取
1). 取0.1 g左右大银鱼背部肌肉，剪碎放入 1.5ml eppendorf 管中。向组织样中加入裂解液（440μL STE，15μL 10mg/ml PK，50μL 10% SDS），56℃消化过夜。加入与消化液等体积的Tris平衡的苯酚（PH＝8.0），轻轻混匀摇晃30分钟后，12000r/min离心10min，取上清液至新的1.5ml离心管中。
重复步骤1，此次摇晃混匀时间为10min。
2).加入等体积的苯酚和氯仿/异戊醇（24:1），且苯酚和氯仿/异戊醇的总体积等于上清液体积。混匀轻摇10min后，12000r/min离心10 min，取上清液转移至新的1.5ml离心管中。3).加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻混匀摇晃30 min后，12000r/min离心10分钟，取上清液转移至新的1.5ml离心管中。
4).加入两倍上清液体积的冰乙醇进行沉淀。
5).将上述加入冰乙醇的上清液置于冰箱冷冻1小时后，13000r/min离心15min。
6).弃上清液，留沉淀。沉淀用70%酒精清洗1—2次。将离心管倒置，自然晾干。向离心管中加入150ul ddH2O(或TE)溶解，置于冰箱4℃保存备用。
1.2.2目的基因扩增与测序
PC R 扩增引物序列为：
COIF：5’—TGTAAAACGACGGCCAGT—3’
COIR：5’—CAGGAAACAGCTATGACAC—3’
引物为上海铂尚生物技术有限公司合成。实验所用试剂购自大连宝生物科技有限公司。PCR 反应体系为 20μL，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 10μL，正反向引物(20uM)各lμL，DNA 模板2 μL (20 ng/μL)， ddH2O补足至20μL。用ABIVeriti 96 well梯度PCR仪进行扩增反应。扩增条件为循环前94℃预变性3min，每个循环包括：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共循环35次；循环结束后72℃延伸8min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，分子量标准为100 bp DNA Ladder marker。PCR 产物回收纯化送至上海铂尚生物有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1样本采集 2
1.2 基因组DNA提取与目的基因扩增测序 2
1.2.1基因组DNA提取 2
1.2.2目的基因扩增与测序 2
1.3数据处理 3
2 结果与分析 3
2.1大银鱼群体COⅠ基因序列多样性 3
2.2单倍型分析 4
2.3种群遗传多样性分析 4
2.4种群遗传距离和AMOVA分析 5
3讨论 5
3.1关于COⅠ基因 5
3.2大银鱼单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi） 5
3.3大银鱼种群中性检验（Tajima D检验） 6
3.4大银鱼2种群间的遗传分化及基因交流 6
致谢 6
参考文献 6
2个地理种群大银鱼C *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
OⅠ基因序列变异与遗传分化
引言
大银鱼(protosalanx hyaloeranius)属硬骨鱼纲(Osteicthyes)，胡瓜鱼目Osmeriformes)，银鱼科(Salangidae)，大银鱼亚科(Protosalanginae)，大银鱼属(Protosalanx Regan)。大银鱼体长一般为11~16cm，成鱼吻部扁平而尖，呈三角形，下颌稍长于上颌，一年生，繁殖能力强，具有较高的研究价值；大银鱼分布在长江、淮河中下游河道和湖泊水库，在东海、黄海、渤海沿海也有分布，是我国银鱼科中分布较广、产量较高且经济价值较高的经济鱼类。大银鱼是太湖、洪泽湖的传统名特产之一，也是江苏省出口创汇的重要水产品。关于大银鱼的研究主要集中在生物学特性［1］、移殖增殖［2］、种群生态方面［3］，分子方面的研究较少［47］。
线粒体基因具有单一的母性遗传模式，无内含子且几乎不发生重组，与核基因相比，更适合作为DNA 条形码标准标记［8］。Hebert在研究中发现，线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ) 基因序列两端保守性较高，序列的进化速率较快，且引物的通用性高［9］，认为其可以反映物种之间真实的进化关系，因此提出可以利用该特定基因序列进行动物DNA条形编码工作［10］。Ward等通过对COⅠ基因进行分析，有效地对了澳大利亚207种海洋鱼类进行了区分［11］，Schlei等鉴别了鲑科鱼类一个亚科中的3个属［12］，王中铎等也通过COⅠ基因分析，对南海的40种硬骨鱼类进行了有效鉴定［13］。雷光春等度太湖新银鱼COⅠ基因遗传多样性分析也为本研究提供了重要启示［14］。本研究测定了我国太湖和洪泽湖2个地理种群的大银鱼COⅠ基因部分序列，对其遗传结构和遗传多样性进行分析，研究结果有望为大银鱼种质资源的保护和开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 样本采集
本实验大银鱼样本为2014年5月至 2014年9月间采集于太湖(编号为TH)、洪泽湖(编号为HZH)。样品采集后立即用冰盒带回实验室，并保存在 95％乙醇中备用。
1.2 基因组DNA提取与目的基因扩增测序
1.2.1基因组DNA提取
1). 取0.1 g左右大银鱼背部肌肉，剪碎放入 1.5ml eppendorf 管中。向组织样中加入裂解液（440μL STE，15μL 10mg/ml PK，50μL 10% SDS），56℃消化过夜。加入与消化液等体积的Tris平衡的苯酚（PH＝8.0），轻轻混匀摇晃30分钟后，12000r/min离心10min，取上清液至新的1.5ml离心管中。
重复步骤1，此次摇晃混匀时间为10min。
2).加入等体积的苯酚和氯仿/异戊醇（24:1），且苯酚和氯仿/异戊醇的总体积等于上清液体积。混匀轻摇10min后，12000r/min离心10 min，取上清液转移至新的1.5ml离心管中。3).加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻混匀摇晃30 min后，12000r/min离心10分钟，取上清液转移至新的1.5ml离心管中。
4).加入两倍上清液体积的冰乙醇进行沉淀。
5).将上述加入冰乙醇的上清液置于冰箱冷冻1小时后，13000r/min离心15min。
6).弃上清液，留沉淀。沉淀用70%酒精清洗1—2次。将离心管倒置，自然晾干。向离心管中加入150ul ddH2O(或TE)溶解，置于冰箱4℃保存备用。
1.2.2目的基因扩增与测序
PC R 扩增引物序列为：
COIF：5’—TGTAAAACGACGGCCAGT—3’
COIR：5’—CAGGAAACAGCTATGACAC—3’
引物为上海铂尚生物技术有限公司合成。实验所用试剂购自大连宝生物科技有限公司。PCR 反应体系为 20μL，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye) 10μL，正反向引物(20uM)各lμL，DNA 模板2 μL (20 ng/μL)， ddH2O补足至20μL。用ABIVeriti 96 well梯度PCR仪进行扩增反应。扩增条件为循环前94℃预变性3min，每个循环包括：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共循环35次；循环结束后72℃延伸8min。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，分子量标准为100 bp DNA Ladder marker。PCR 产物回收纯化送至上海铂尚生物有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
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