杆菌肽产生菌的诱变育种及发酵工艺优化研究
目 录
1 前言 1
1.1 杆菌肽的性质 1
1.2 杆菌肽的生物合成机制 3
1.3杆菌肽生产中常用的高产策略 3
1.3.1 诱变育种 3
1.3.2代谢调控 4
1.4 杆菌肽测量方法 5
1.5课题研究的目的以及意义 5
2 实验部分 6
2.1实验仪器 6
2.2 主要药品及试剂 7
2.3 培养基 7
2.3.1 杆菌肽分离培养基制备 7
2.3.2 斜面制备 8
2.3.3 种子罐培养 9
2.3.4 发酵罐培养 9
2.3实验方法 9
2.3.1杆菌肽的检测方法 9
2.3.2 菌种的活化 11
2.3.3 紫外诱变的过程 11
2.3.4 发酵培养基优化 12
3 结果与分析 12
3.1 紫外诱变结果与分析 12
3.1.1 诱变条件的确定 12
3.1.2杆菌肽液相色谱检测方法的确定 13
3.1.4正突变菌株的筛选 16
3.3 培养基的优化 16
3.3.1氮源的影响 16
3.3.2 碳源的影响 17
3.3.3 碳质量分数的影响 18
3.3.4 培养基体积的影响 18
3.3.5 pH值的影响 19
4 展望 21
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
1 前言
杆菌肽是?1945年由美国哥伦比亚 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
大学B.H.Johnson 分离到一株具有产生抗菌物质的枯草芽孢杆菌，而从此菌的发酵产物中通过分离取得到的成品[1]。地衣芽孢杆菌是我国农业部 2003 年在318 号公告中批准使用的饲料级菌株之一[2]。它是能够产生芽孢的兼性厌氧微生物，在分类学上属于原核生物真细菌。地衣芽孢杆菌具有很多有点，比如菌体繁殖速度很快、容易培养、抗逆性很强、耐挤压和高温、耐酸和碱，并且能够分泌淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多种酶。杆菌肽产品应用范围非常广范，特别是在医药和畜牧养殖方面有较高的使用价值[3,4]。
杆菌肽由于效果好，毒副作用弱、不易产生交叉的耐药性的优点，使得其有着非常广泛应用前景。在1960 年，杆菌肽被美国的 FDA 批准用作饲料添加剂，这使得杆菌肽的产业进入了快速发展时期[5]。杆菌肽对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，尤其是对葡萄球菌属、沙门氏菌属、棒状杆菌属和梭状芽孢杆菌属等病原体极为敏感，对部分革兰氏阴性菌、螺旋菌抑制效果也是很明显的[6]。因此，杆菌肽可以利用通过抑制菌的生长来增强一般机体的免疫功能作用，从而减少发病，促进机体的生长。杆菌肽能使畜禽肠壁变薄，使肠壁的通透性增强的作用，从而改善肠道代谢的环境来促进营养的消化和吸收，使其在畜牧养殖领域具有巨大应用前景[7]。
1.1 杆菌肽的性质
杆菌肽又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素。实际上杆菌肽是几种相似多肽组分的混合物，通过其中的某些氨基酸不同来区别。杆菌肽的结构是由12个氨基酸组成的，含有噻唑环多肽复合体，它是由多种不同或相同氨基酸结合而成的不稳定的多肽结构，含A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等多种组分[8]，其中我们以杆菌肽A为主（如图1为其结构）。杆菌肽易溶于水，系白色粉末。在pH 5- 7水溶液中可稳定存在4周。杆菌肽可与多数金属离子生成络合物，并在干燥状态下较稳定杆菌肽锌在室温下保存3年其效价不变。杆菌肽是一种类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，具有吸湿性，易被氧化剂等破坏，在溶液中能被多种重金属盐类作用使其沉淀，杆菌肽在水中是易溶的，在乙醇中会溶解，在丙酮、三氯、甲烷或乙醚中一般是不溶的[9]。
图 1 杆菌肽A的分子结构式
图2 杆菌肽的已知不同组分
杆菌肽 A B1 B2 B3 C1 C2 C3 E
X L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
Y L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
R (a) (b) (a) (a) (b) (b) (a) (b)
杆菌肽 F H1 H2 H3 I1 I2 I3
X L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
Y L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
R (c) (d) (c) (c) (d) (d) (c)
1.2 杆菌肽的生物合成机制
一般氨基酸聚合形成多肽类化合物有着不同的机理，有3种[10]：① 氨基酸活化生成磷酸酯，它被一种特定的酶催化缩合从而形成肽类化合物，如谷胱甘肽就是在初级代谢阶段通过这种方式合成的；一些小肽通常也都用这种方式合成，如蛋白酶抑制剂亮抑肽酶；② 大分子聚肽链通过蛋白质合成的常规途径经转录、翻译系统合成；③ 经非核糖体肽合成酶将氨基酸经过活化后按硫模板机理缩合，从而来形成肽链。
杆菌肽的生物合成途径是按硫模板机理，由NRPS催化的多肽合成途径。一般NRPS是通过组成模块形式的多功能酶，它每一模块都含有一种独特、不重复的催化功能区域，它的催化功能区域与其产物合成顺序是一一对应。一个基本的NRPS延伸模块至少包括3个催化功能域：缩合结构域C domain-腺苷化结构域A domain-肽酰转运蛋白T domain[11]。其中，A 结构域是模块中基本的结构，它属于腺苷酸合成酶的一种，包含有550个氨基酸。T 结构域由80个氨基酸组成，与酰基转运蛋白有高度同源性。该结构中有一段高度保守的序列LGGxSI(x为任意氨基酸) 作为4-PP 的结合位点，用于转运活化后的氨基酸。C 结构域一般由350个氨基酸组成，用来催化形成肽键的，该结构域通常处于两个A结构域之间而存在。
1.3杆菌肽生产中常用的高产策略
1.3.1 诱变育种
一般随机突变和批量是筛选杆菌肽高产菌株选育主要采用的方法。如对地衣芽孢杆菌进行紫外线照射方法和快中子辐射方法相结合进行诱变处理，从而得到杆菌肽摇瓶效价较出发菌株提高23% 的突变菌株[12]。Aftab通过物理诱变(UV)和化学诱变（MNNG，HNO2）复合处理，筛选出高产的Bacillus licheniformis UV-MN-HN-6，生物效价为（59.1土135）IU/mL[13]。诱变育种的工作量大，一般费时费力，有时效果又不是很明显，随机性很高。我们如果结合杆菌肽生物合成过程及优化分子调控机制，并且通过诱变等手段来引发变异，然后通过设计筛选方案来获得关键的高产菌株，就有可能提高育种的效率。
作为我国生物制药支柱产业之一的抗生素的生产，整体发酵水平还不高，其主要原因还是对菌种代谢及调控的认识不够透彻，而且培养基的成分、质量与代谢产物的发酵密切相关，它的成分和配比决定了微生物菌体生长代谢的方向和速度、从而影响菌体细胞产生目的产物的能力。在菌种的代谢途径及代谢产物的生物合成途径研究中，我们通常会使用到合成培养基或半合成培养基，这些培养基成分一般很精确，并且重复性高；但是价格昂贵、配制较繁琐。而且由于天然培养基与合成培养基之间营养成分存在较大差距，研究所得的结果在工业生。产中往往无法得到很好的消化[17]。如能在现有代谢网络的研究基础上，以工业中被大量使用的培养基作为平台，对其中的各种成分进行准确的定性定量，并结合发酵过程，研究培养液中各种成分与微生物代谢的关系，可以大大缩短科研与生产之间的距离，有利于通过代谢工程的手段，迅速提高工业化生产水平、提高多组分产物中的目标产物含量或得到新的产物。
1 前言 1
1.1 杆菌肽的性质 1
1.2 杆菌肽的生物合成机制 3
1.3杆菌肽生产中常用的高产策略 3
1.3.1 诱变育种 3
1.3.2代谢调控 4
1.4 杆菌肽测量方法 5
1.5课题研究的目的以及意义 5
2 实验部分 6
2.1实验仪器 6
2.2 主要药品及试剂 7
2.3 培养基 7
2.3.1 杆菌肽分离培养基制备 7
2.3.2 斜面制备 8
2.3.3 种子罐培养 9
2.3.4 发酵罐培养 9
2.3实验方法 9
2.3.1杆菌肽的检测方法 9
2.3.2 菌种的活化 11
2.3.3 紫外诱变的过程 11
2.3.4 发酵培养基优化 12
3 结果与分析 12
3.1 紫外诱变结果与分析 12
3.1.1 诱变条件的确定 12
3.1.2杆菌肽液相色谱检测方法的确定 13
3.1.4正突变菌株的筛选 16
3.3 培养基的优化 16
3.3.1氮源的影响 16
3.3.2 碳源的影响 17
3.3.3 碳质量分数的影响 18
3.3.4 培养基体积的影响 18
3.3.5 pH值的影响 19
4 展望 21
结 论 22
致 谢 23
参 考 文 献 24
1 前言
杆菌肽是?1945年由美国哥伦比亚 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
大学B.H.Johnson 分离到一株具有产生抗菌物质的枯草芽孢杆菌，而从此菌的发酵产物中通过分离取得到的成品[1]。地衣芽孢杆菌是我国农业部 2003 年在318 号公告中批准使用的饲料级菌株之一[2]。它是能够产生芽孢的兼性厌氧微生物，在分类学上属于原核生物真细菌。地衣芽孢杆菌具有很多有点，比如菌体繁殖速度很快、容易培养、抗逆性很强、耐挤压和高温、耐酸和碱，并且能够分泌淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多种酶。杆菌肽产品应用范围非常广范，特别是在医药和畜牧养殖方面有较高的使用价值[3,4]。
杆菌肽由于效果好，毒副作用弱、不易产生交叉的耐药性的优点，使得其有着非常广泛应用前景。在1960 年，杆菌肽被美国的 FDA 批准用作饲料添加剂，这使得杆菌肽的产业进入了快速发展时期[5]。杆菌肽对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，尤其是对葡萄球菌属、沙门氏菌属、棒状杆菌属和梭状芽孢杆菌属等病原体极为敏感，对部分革兰氏阴性菌、螺旋菌抑制效果也是很明显的[6]。因此，杆菌肽可以利用通过抑制菌的生长来增强一般机体的免疫功能作用，从而减少发病，促进机体的生长。杆菌肽能使畜禽肠壁变薄，使肠壁的通透性增强的作用，从而改善肠道代谢的环境来促进营养的消化和吸收，使其在畜牧养殖领域具有巨大应用前景[7]。
1.1 杆菌肽的性质
杆菌肽又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素。实际上杆菌肽是几种相似多肽组分的混合物，通过其中的某些氨基酸不同来区别。杆菌肽的结构是由12个氨基酸组成的，含有噻唑环多肽复合体，它是由多种不同或相同氨基酸结合而成的不稳定的多肽结构，含A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等多种组分[8]，其中我们以杆菌肽A为主（如图1为其结构）。杆菌肽易溶于水，系白色粉末。在pH 5- 7水溶液中可稳定存在4周。杆菌肽可与多数金属离子生成络合物，并在干燥状态下较稳定杆菌肽锌在室温下保存3年其效价不变。杆菌肽是一种类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，具有吸湿性，易被氧化剂等破坏，在溶液中能被多种重金属盐类作用使其沉淀，杆菌肽在水中是易溶的，在乙醇中会溶解，在丙酮、三氯、甲烷或乙醚中一般是不溶的[9]。
图 1 杆菌肽A的分子结构式
图2 杆菌肽的已知不同组分
杆菌肽 A B1 B2 B3 C1 C2 C3 E
X L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
Y L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
R (a) (b) (a) (a) (b) (b) (a) (b)
杆菌肽 F H1 H2 H3 I1 I2 I3
X L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
Y L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile L-Ile
R (c) (d) (c) (c) (d) (d) (c)
1.2 杆菌肽的生物合成机制
一般氨基酸聚合形成多肽类化合物有着不同的机理，有3种[10]：① 氨基酸活化生成磷酸酯，它被一种特定的酶催化缩合从而形成肽类化合物，如谷胱甘肽就是在初级代谢阶段通过这种方式合成的；一些小肽通常也都用这种方式合成，如蛋白酶抑制剂亮抑肽酶；② 大分子聚肽链通过蛋白质合成的常规途径经转录、翻译系统合成；③ 经非核糖体肽合成酶将氨基酸经过活化后按硫模板机理缩合，从而来形成肽链。
杆菌肽的生物合成途径是按硫模板机理，由NRPS催化的多肽合成途径。一般NRPS是通过组成模块形式的多功能酶，它每一模块都含有一种独特、不重复的催化功能区域，它的催化功能区域与其产物合成顺序是一一对应。一个基本的NRPS延伸模块至少包括3个催化功能域：缩合结构域C domain-腺苷化结构域A domain-肽酰转运蛋白T domain[11]。其中，A 结构域是模块中基本的结构，它属于腺苷酸合成酶的一种，包含有550个氨基酸。T 结构域由80个氨基酸组成，与酰基转运蛋白有高度同源性。该结构中有一段高度保守的序列LGGxSI(x为任意氨基酸) 作为4-PP 的结合位点，用于转运活化后的氨基酸。C 结构域一般由350个氨基酸组成，用来催化形成肽键的，该结构域通常处于两个A结构域之间而存在。
1.3杆菌肽生产中常用的高产策略
1.3.1 诱变育种
一般随机突变和批量是筛选杆菌肽高产菌株选育主要采用的方法。如对地衣芽孢杆菌进行紫外线照射方法和快中子辐射方法相结合进行诱变处理，从而得到杆菌肽摇瓶效价较出发菌株提高23% 的突变菌株[12]。Aftab通过物理诱变(UV)和化学诱变（MNNG，HNO2）复合处理，筛选出高产的Bacillus licheniformis UV-MN-HN-6，生物效价为（59.1土135）IU/mL[13]。诱变育种的工作量大，一般费时费力，有时效果又不是很明显，随机性很高。我们如果结合杆菌肽生物合成过程及优化分子调控机制，并且通过诱变等手段来引发变异，然后通过设计筛选方案来获得关键的高产菌株，就有可能提高育种的效率。
作为我国生物制药支柱产业之一的抗生素的生产，整体发酵水平还不高，其主要原因还是对菌种代谢及调控的认识不够透彻，而且培养基的成分、质量与代谢产物的发酵密切相关，它的成分和配比决定了微生物菌体生长代谢的方向和速度、从而影响菌体细胞产生目的产物的能力。在菌种的代谢途径及代谢产物的生物合成途径研究中，我们通常会使用到合成培养基或半合成培养基，这些培养基成分一般很精确，并且重复性高；但是价格昂贵、配制较繁琐。而且由于天然培养基与合成培养基之间营养成分存在较大差距，研究所得的结果在工业生。产中往往无法得到很好的消化[17]。如能在现有代谢网络的研究基础上，以工业中被大量使用的培养基作为平台，对其中的各种成分进行准确的定性定量，并结合发酵过程，研究培养液中各种成分与微生物代谢的关系，可以大大缩短科研与生产之间的距离，有利于通过代谢工程的手段，迅速提高工业化生产水平、提高多组分产物中的目标产物含量或得到新的产物。
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