马鞭草中总黄酮的含量测定(附件)
摘 要马鞭草为马鞭草科多年生植物，又名紫顶龙牙草、燕尾草等，始载于《名医别录》。马鞭草在中国作为传统中药，具有清热解毒、利尿消肿、活血通经等功效。黄酮类化合物具有多种生物活性，主要表现在对心血管的作用、抗肝损伤作用、解痉作用、对呼吸系统的作用、雌激素样作用、抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用、抗氧化作用等，在医药、食品保健等方面已被广泛应用。以总黄酮作为指标性成分，根据所含黄酮类化合物的结构类型、理化及光谱性质，对其进行含量测定，是中药及其制剂质量控制的重要研究内容。本本课题以芦丁为对照品，建立了紫外可见分光光度法于504nm处测定马鞭草中总黄酮含量的方法，为马鞭草的合理利用和质量控制提供了一定的科学依据。
目 录
1 绪论 1
1.1 马鞭草的研究概况 1
1.1.1 概念 1
1.1.2 产地 1
1.2 马鞭草药理作用及临床应用 1
1.2.1 抗癌作用 1
1.2.2 抗早孕作用 1
1.2.3 免疫调节作用 2
1.2.4 抗炎抗病毒作用 2
1.2.5 促进神经生长因子介导的轴突生长 3
1.2.6 抗微生物活性 3
1.2.7 其他作用 3
1.3 马鞭草化学成分研究现状 3
1.3.1 三萜类化合物 3
1.3.2 甾体类化合物 4
1.3.3 挥发油类化合物 4
1.3.4 脂肪酸类化合物 4
1.3.5 糖苷类化合物 4
1.3.6 马鞭草糖苷类化合物研究现状 4
1.4 总黄酮的研究历史 5
1.5 总黄酮含量测定的方法 5
1.5.1 紫外分光光度法 5
1.5.2 金属离子络合法 5
1.5.3 荧光分析法 7
1.5.4 高效液相色谱法 7
1.5.5 毛细管电泳法 8
2 实验部分 9
2.1 实验材料 9
2.2 实验设备 9
2.3 实验过程 9
2.3.1 供试品溶液的制备 9
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
3.2 制备对照品的芦丁溶液 9
2.3.3 测定波长的选择 9
2.3.4 标准曲线的制备 10
2.3.6 精密度试验 11
2.3.7 稳定性试验 11
2.3.8 加样回收率试验 11
2.3.9 总黄酮含量的测定 12
结论 13
参考文献 14
致谢 15
1 绪论
1.1 马鞭草的研究概况
1.1.1 概念
马鞭草为马鞭草科多年生植物，又名紫顶龙牙草、燕尾草等，始载于《名医别录》[1]。马鞭草作为中国的传统中药被长期使用，具有散瘀活血、解毒清热、消肿利水等功效；可用于治疗流行性感冒、疟疾、咳嗽、白喉等病状[2]。在中国药典2015年版一部中记载着马鞭草用于癥瘕积聚，痛经经闭，喉痹，痈肿，水肿，黄疸等病；现代医学研究表明马鞭草具有止血、抗菌、止痛、消炎等作用。国外对马鞭草的研究始于20世纪初，后来研究人员相继从马鞭草中分离出了几十种化合物，并确定部分化合物有抗癌、镇痛、免疫活性等药理作用[2]。
1.1.2 产地
马鞭草通常情况下高度为30120厘米，主根近木质，黄白色，多分枝；有多数须根；茎四棱形，双子叶对生；其花成蓝紫色，秋夏开放。全世界的温带至热带地区均有分布[3]。马鞭草怕涝、喜湿润、不耐干旱、喜肥，生长在低至高海拔的山坡、树林旁、溪边或路边。广泛分布于中国的陕西、江浙、西南等地；其在国外分布亦广泛，主产热带美洲。
1.2 马鞭草药理作用及临床应用
1.2.1 抗癌作用
徐昌苏、焦中秀等研究者表明对于绒毛膜癌JAR细胞增值马鞭草的醇提物有非常明显的抑制作用，且有特异性和抗绒癌作用[4]。
1.2.2 抗早孕作用
马鞭草醇提物是孕妇忌用药物，徐昌芬等以正常妊娠6～8周早孕绒毛组织体外培养为实验手段，研究了马鞭草抗早孕的细胞学作用原理，观察了马鞭草乙醇提取液对绒毛滋养层细胞光镜、电镜、免疫组织化学等形态学变化及对绒毛膜促性腺激素(HCG)分泌功能的影响。结果表明25g/L马鞭草提取液能明显抑制细胞生长及激素分泌；加药后48h超微结构显示，微绒毛明显减少，内质网高度扩张，线粒体有髓样改变，染色质固缩、并聚集在核膜下HCG分泌量48h后仅为对照组的1/4。免疫组织化学反应也显示，在滋养层细胞内HCG及SDH明显减弱。筛选出了对马鞭草有明显抑制作用的醇提液有效部位，并研究了对其作用机制，结果发现在某一浓度范围内的马鞭草C 部位能致滋养细胞及蜕膜退行性改变，胎盘组织萎缩，血流量减少，从而影响胚胎正常的生长发育。从而更深入说明马鞭草具有抗早孕的作用[4]。张曙萱等选用早孕人工流产蜕膜组织进行体外培养，观察马鞭草提取液A、B、C、D及米非司酮对蜕膜细胞形态，增殖，细胞凋亡及细胞周期动力学的影响，表明马鞭草、米非司酮均有抗早孕作用。抑制蜕膜细胞生长，促进凋亡为其抗早孕机制之一。徐昌芬等选用以人早孕滋养层细胞体外培养作为实验手段，筛选出对马鞭草有明显抑制作用的醇提液有效部位，并对其作用机制进行了研究，结果发现一定浓度的马鞭草C部位能致滋养细胞及蜕膜退行性改变，胎盘组织萎缩，血流量减少，从而影响胚胎正常的生长发育。
1.2.3 免疫调节作用
王文佳等探讨马鞭草抗感染的免疫活性机制并，进行了马鞭草醇提物对小鼠免疫功能影响的研究[5]。结果表明马鞭草醇提物明显增了强小鼠 T 淋巴细胞增殖能力、抗体形成细胞分泌抗体的能力( P＜0.05 或＜0.01) ，且抑制了小鼠吞噬细胞功能( P＜0.05) 。提示马鞭草醇提物具有增强小鼠T、B细胞免疫功能和抑制小鼠吞噬细胞功能的作用，这可能与该药抗炎、抗感染、抗癌等作用有关。他们还观察马鞭草醇提物对小鼠白细胞介素2(IL2)生物活性的影响，表明一定剂量马鞭草醇提物对小鼠IL2的生物活性具有增强作用。从而更深入说明马鞭草具有免疫调节作用[5]。
1.2.4 抗炎抗病毒作用
N.E.Hernandez等发现马鞭草可以明显的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并表明马鞭草中所含的黄酮类化合物与这方面的活性有关。Deepak等等发现马鞭草的石油醚、氯仿、甲醇提取物别用于角叉菜胶足肿胀模型，结果显示三种提取物均有抗炎活性，其中氯仿提取物的活性最强。马鞭草的水及醇提取物对滴入家兔结膜囊内的芥子油引起的炎症都有消炎作用。家兔齿髓电刺激法表明，马鞭草水提物在给药后1h有镇痛作用，3h后作用消失，醇提取物的镇痛作用6h后仍未消失，水溶部性分作用更久，而水不溶部分则无镇痛作用。
1.2.5 促进神经生长因子介导的轴突生长
从马鞭草分离得到的化合物littoachalcone不影响PC12D细胞形态，但显著增加神经生长因子(NGF)介导的轴突细胞的比率，当化合物littorachalcone(3～30μm)加2μg/mLNGF时，轴突细胞的比例大约与30μg/mLNGF单独作用时相同或稍大。而钩吻醇6’反式咖啡酞基1葡糖苷具有微弱的增强神经生长因子介导的轴突生长的作用。
1.2.6 抗微生物活性
体外试验马鞭草水煎剂在31mg/mL时，能杀死钩端螺旋体。马鞭草全草煎剂对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、白喉杆菌有抑制作用。马鞭草苷对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血链球菌、卡他球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌、伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌、志贺氏痢疾杆菌、流感杆菌、斯密兹氏痢疾杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌有抑制作用。此外，马鞭草对甲型流感病毒(681株)、副流感病毒仙台株有抑制作用。Hernbndez等发现马鞭草中的总黄酮对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物都有抑制作用；而马鞭草非苷化部分中的亲脂性成分能刺激小鼠网状内皮组织的噬菌作用，当给小鼠腹腔注射致死剂量的埃希氏大肠杆菌时，能起到保护小鼠的作用。
目 录
1 绪论 1
1.1 马鞭草的研究概况 1
1.1.1 概念 1
1.1.2 产地 1
1.2 马鞭草药理作用及临床应用 1
1.2.1 抗癌作用 1
1.2.2 抗早孕作用 1
1.2.3 免疫调节作用 2
1.2.4 抗炎抗病毒作用 2
1.2.5 促进神经生长因子介导的轴突生长 3
1.2.6 抗微生物活性 3
1.2.7 其他作用 3
1.3 马鞭草化学成分研究现状 3
1.3.1 三萜类化合物 3
1.3.2 甾体类化合物 4
1.3.3 挥发油类化合物 4
1.3.4 脂肪酸类化合物 4
1.3.5 糖苷类化合物 4
1.3.6 马鞭草糖苷类化合物研究现状 4
1.4 总黄酮的研究历史 5
1.5 总黄酮含量测定的方法 5
1.5.1 紫外分光光度法 5
1.5.2 金属离子络合法 5
1.5.3 荧光分析法 7
1.5.4 高效液相色谱法 7
1.5.5 毛细管电泳法 8
2 实验部分 9
2.1 实验材料 9
2.2 实验设备 9
2.3 实验过程 9
2.3.1 供试品溶液的制备 9
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
3.2 制备对照品的芦丁溶液 9
2.3.3 测定波长的选择 9
2.3.4 标准曲线的制备 10
2.3.6 精密度试验 11
2.3.7 稳定性试验 11
2.3.8 加样回收率试验 11
2.3.9 总黄酮含量的测定 12
结论 13
参考文献 14
致谢 15
1 绪论
1.1 马鞭草的研究概况
1.1.1 概念
马鞭草为马鞭草科多年生植物，又名紫顶龙牙草、燕尾草等，始载于《名医别录》[1]。马鞭草作为中国的传统中药被长期使用，具有散瘀活血、解毒清热、消肿利水等功效；可用于治疗流行性感冒、疟疾、咳嗽、白喉等病状[2]。在中国药典2015年版一部中记载着马鞭草用于癥瘕积聚，痛经经闭，喉痹，痈肿，水肿，黄疸等病；现代医学研究表明马鞭草具有止血、抗菌、止痛、消炎等作用。国外对马鞭草的研究始于20世纪初，后来研究人员相继从马鞭草中分离出了几十种化合物，并确定部分化合物有抗癌、镇痛、免疫活性等药理作用[2]。
1.1.2 产地
马鞭草通常情况下高度为30120厘米，主根近木质，黄白色，多分枝；有多数须根；茎四棱形，双子叶对生；其花成蓝紫色，秋夏开放。全世界的温带至热带地区均有分布[3]。马鞭草怕涝、喜湿润、不耐干旱、喜肥，生长在低至高海拔的山坡、树林旁、溪边或路边。广泛分布于中国的陕西、江浙、西南等地；其在国外分布亦广泛，主产热带美洲。
1.2 马鞭草药理作用及临床应用
1.2.1 抗癌作用
徐昌苏、焦中秀等研究者表明对于绒毛膜癌JAR细胞增值马鞭草的醇提物有非常明显的抑制作用，且有特异性和抗绒癌作用[4]。
1.2.2 抗早孕作用
马鞭草醇提物是孕妇忌用药物，徐昌芬等以正常妊娠6～8周早孕绒毛组织体外培养为实验手段，研究了马鞭草抗早孕的细胞学作用原理，观察了马鞭草乙醇提取液对绒毛滋养层细胞光镜、电镜、免疫组织化学等形态学变化及对绒毛膜促性腺激素(HCG)分泌功能的影响。结果表明25g/L马鞭草提取液能明显抑制细胞生长及激素分泌；加药后48h超微结构显示，微绒毛明显减少，内质网高度扩张，线粒体有髓样改变，染色质固缩、并聚集在核膜下HCG分泌量48h后仅为对照组的1/4。免疫组织化学反应也显示，在滋养层细胞内HCG及SDH明显减弱。筛选出了对马鞭草有明显抑制作用的醇提液有效部位，并研究了对其作用机制，结果发现在某一浓度范围内的马鞭草C 部位能致滋养细胞及蜕膜退行性改变，胎盘组织萎缩，血流量减少，从而影响胚胎正常的生长发育。从而更深入说明马鞭草具有抗早孕的作用[4]。张曙萱等选用早孕人工流产蜕膜组织进行体外培养，观察马鞭草提取液A、B、C、D及米非司酮对蜕膜细胞形态，增殖，细胞凋亡及细胞周期动力学的影响，表明马鞭草、米非司酮均有抗早孕作用。抑制蜕膜细胞生长，促进凋亡为其抗早孕机制之一。徐昌芬等选用以人早孕滋养层细胞体外培养作为实验手段，筛选出对马鞭草有明显抑制作用的醇提液有效部位，并对其作用机制进行了研究，结果发现一定浓度的马鞭草C部位能致滋养细胞及蜕膜退行性改变，胎盘组织萎缩，血流量减少，从而影响胚胎正常的生长发育。
1.2.3 免疫调节作用
王文佳等探讨马鞭草抗感染的免疫活性机制并，进行了马鞭草醇提物对小鼠免疫功能影响的研究[5]。结果表明马鞭草醇提物明显增了强小鼠 T 淋巴细胞增殖能力、抗体形成细胞分泌抗体的能力( P＜0.05 或＜0.01) ，且抑制了小鼠吞噬细胞功能( P＜0.05) 。提示马鞭草醇提物具有增强小鼠T、B细胞免疫功能和抑制小鼠吞噬细胞功能的作用，这可能与该药抗炎、抗感染、抗癌等作用有关。他们还观察马鞭草醇提物对小鼠白细胞介素2(IL2)生物活性的影响，表明一定剂量马鞭草醇提物对小鼠IL2的生物活性具有增强作用。从而更深入说明马鞭草具有免疫调节作用[5]。
1.2.4 抗炎抗病毒作用
N.E.Hernandez等发现马鞭草可以明显的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并表明马鞭草中所含的黄酮类化合物与这方面的活性有关。Deepak等等发现马鞭草的石油醚、氯仿、甲醇提取物别用于角叉菜胶足肿胀模型，结果显示三种提取物均有抗炎活性，其中氯仿提取物的活性最强。马鞭草的水及醇提取物对滴入家兔结膜囊内的芥子油引起的炎症都有消炎作用。家兔齿髓电刺激法表明，马鞭草水提物在给药后1h有镇痛作用，3h后作用消失，醇提取物的镇痛作用6h后仍未消失，水溶部性分作用更久，而水不溶部分则无镇痛作用。
1.2.5 促进神经生长因子介导的轴突生长
从马鞭草分离得到的化合物littoachalcone不影响PC12D细胞形态，但显著增加神经生长因子(NGF)介导的轴突细胞的比率，当化合物littorachalcone(3～30μm)加2μg/mLNGF时，轴突细胞的比例大约与30μg/mLNGF单独作用时相同或稍大。而钩吻醇6’反式咖啡酞基1葡糖苷具有微弱的增强神经生长因子介导的轴突生长的作用。
1.2.6 抗微生物活性
体外试验马鞭草水煎剂在31mg/mL时，能杀死钩端螺旋体。马鞭草全草煎剂对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、白喉杆菌有抑制作用。马鞭草苷对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血链球菌、卡他球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌、伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌、志贺氏痢疾杆菌、流感杆菌、斯密兹氏痢疾杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌有抑制作用。此外，马鞭草对甲型流感病毒(681株)、副流感病毒仙台株有抑制作用。Hernbndez等发现马鞭草中的总黄酮对革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物都有抑制作用；而马鞭草非苷化部分中的亲脂性成分能刺激小鼠网状内皮组织的噬菌作用，当给小鼠腹腔注射致死剂量的埃希氏大肠杆菌时，能起到保护小鼠的作用。
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